基因敲除

基因敲除

一、基因敲除简介

基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。

二、基因敲除的方法及原理

1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。其中应用最多的是PNS法。通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

例题(18分）

1. 基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：

该技术的主要步骤及应用如下：

（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。

（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。

（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞。用含_____________的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基______________所有能表达HSV - TK基因的细胞（含HSV - TK基因的细胞能将无毒的GCV 转化成有毒的药物）。

（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入_______________体内，使其发育成嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与_________小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠。

（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究________的目的；通过敲除抗原决定基因，还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除________。

答案：

2. 研究者取野生型小鼠（Ⅰ+Ⅰ+)的胚胎干细胞，转入含neo r基因（新霉素抗性基因）的DNA片段，定向突变Ⅰ+基因（结果如图1),再将突变的胚胎干细胞移回野生型小鼠胚胎，培育出带突变基因（Ⅰ-）的杂合子小鼠。

(1)将外源DNA片段导入胚胎干细胞后，需用含的培养基培养细胞，以筛选得到突变的胚胎干细胞。

(2)用此杂合体小鼠与野生型小鼠进行杂交实验，并通过DNA分子杂交技术检测小鼠的基因型，结果如图2。

①检测小鼠的基因型，需根据序列设计DNA分子探针。根据杂交实验结果推测，I基因的功能是与

有关。

②分析系谱图 (能/不能）判断Ⅰ+、Ⅰ-基因的显、隐性，理由是 .

③只有突变基因来自 (父本/母本）时，杂合子小鼠才表现出发育迟缓，由此推测来自的I基因在体细胞中不表达。

④提取小鼠体细胞的总RNA,加入Actin基因（编码细胞骨架蛋白）和net r基因的RNA探针，之后加入RNA酶水解单链RNA。若探针能与细胞样品的RNA结合成双链RNA则不被酶水解而保留，电泳分析时呈现明显条带（在记录实验结果时，有明显条带用“+”表示，无明显条带用“一”表示)。请将支持③推测的实验结果填入下表ⅰ、ⅱ、ⅲ处。

(3)杂合子小鼠雌雄个体交配，则后代的表现型及比例为。

答案(18分，每空2分）

(1)新霉素

(2)①外显子2和neo r基因生长发育

②不能

杂合子小鼠既有体型正常的，又有发育迟级、体型瘦弱的，无法判断性状的显、隐性，所以也无法判断Ⅰ+、Ⅰ-

‘基因的显、隐性

③父本母本

④ⅰ: 一、ⅱ：+、ⅲ：一

(3)野生型：发育迟缓型=1:1

3.（16分，除特殊说明每空2分，图解2分）

科研工作者利用胚胎干细胞和基因敲除技术改造老鼠体内的特定靶基因，使实验鼠体内的靶基因失去作用，从而发现这些基因的实际功能，这种技术的应用，使我们能够更深入地了解胚胎发育、老化以及疾病的过程。基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段（部分序列与靶基因相同，从而使该片段特异性插入靶基因）使靶基因突变而达到基因敲除的目的。原理如图：

科研工作者获取稳定遗传的纯合体基因敲除小鼠一般经历下列过程：

(1)获取干细胞悬浮液

科学家将动物胚胎组织用处理使其细胞离散，再通过CO2培养箱培养胚胎干细胞。CO2的作用是；胚胎干细胞分化为不同组织器官的原因是。

(2)构建重组DNA分子

构建含有“同源性片段”的重组DNA分子时要用到的工具酶有；该实验病毒的作用是_____________。

（3）获取含重组基因的干细胞

基因转移的同源重组自然发生率极低（动物的重组概率为10-2～10-5），因此“同源性片段”含有的标记基因作用非常重要，可采用__________________技术检测或利用选择培养基筛选。靶基因被插入同源性片段后发生基因突变，该特异性插入突变克服了自然诱发突变或人工物理、化学诱发突变的______________特点，便于专一性研究靶基因的功能。