基因敲除

基因敲除
一、基因敲除简介
基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。

基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。

指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。

此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。

二、基因敲除的方法及原理
1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。

将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。

将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。

目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。

其中应用最多的是PNS法。

通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

例题(18分）
1. 基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：
该技术的主要步骤及应用如下：
（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。

（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。

（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞。

用含_____________的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基______________所有能表达HSV - TK基因的细胞（含HSV - TK基因的细胞能将无毒的GCV 转化成有毒的药物）。

（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入_______________体内，使其发育成嵌合体小鼠。

嵌合体小鼠与_________小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠。

（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究________的目的；通过敲除抗原决定基因，还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除________。

答案：
2. 研究者取野生型小鼠（Ⅰ+Ⅰ+)的胚胎干细胞，转入含neo r基因（新霉素抗性基因）的DNA片段，定向突变Ⅰ+基因（结果如图1),再将突变的胚胎干细胞移回野生型小鼠胚胎，培育出带突变基因（Ⅰ-）的杂合子小鼠。

(1)将外源DNA片段导入胚胎干细胞后，需用含的培养基培养细胞，以筛选得到突变的胚胎干细胞。

(2)用此杂合体小鼠与野生型小鼠进行杂交实验，并通过DNA分子杂交技术检测小鼠的基因型，结果如图2。

①检测小鼠的基因型，需根据序列设计DNA分子探针。

根据杂交实验结果推测，I基因的功能是与
有关。

②分析系谱图 (能/不能）判断Ⅰ+、Ⅰ-基因的显、隐性，理由是 .
③只有突变基因来自 (父本/母本）时，杂合子小鼠才表现出发育迟缓，由此推测来自的I基因在体细胞中不表达。

④提取小鼠体细胞的总RNA,加入Actin基因（编码细胞骨架蛋白）和net r基因的RNA探针，之后加入RNA酶水解单链RNA。

若探针能与细胞样品的RNA结合成双链RNA则不被酶水解而保留，电泳分析时呈现明显条带（在记录实验结果时，有明显条带用“+”表示，无明显条带用“一”表示)。

请将支持③推测的实验结果填入下表ⅰ、ⅱ、ⅲ处。

(3)杂合子小鼠雌雄个体交配，则后代的表现型及比例为。

答案(18分，每空2分）
(1)新霉素
(2)①外显子2和neo r基因生长发育
②不能
杂合子小鼠既有体型正常的，又有发育迟级、体型瘦弱的，无法判断性状的显、隐性，所以也无法判断Ⅰ+、Ⅰ-
‘基因的显、隐性
③父本母本
④ⅰ: 一、ⅱ：+、ⅲ：一
(3)野生型：发育迟缓型=1:1
3.（16分，除特殊说明每空2分，图解2分）
科研工作者利用胚胎干细胞和基因敲除技术改造老鼠体内的特定靶基因，使实验鼠体内的靶基因失去作用，从而发现这些基因的实际功能，这种技术的应用，使我们能够更深入地了解胚胎发育、老化以及疾病的过程。

基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段（部分序列与靶基因相同，从而使该片段特异性插入靶基因）使靶基因突变而达到基因敲除的目的。

原理如图：
科研工作者获取稳定遗传的纯合体基因敲除小鼠一般经历下列过程：
(1)获取干细胞悬浮液
科学家将动物胚胎组织用处理使其细胞离散，再通过CO2培养箱培养胚胎干细胞。

CO2的作用是；胚胎干细胞分化为不同组织器官的原因是。

(2)构建重组DNA分子
构建含有“同源性片段”的重组DNA分子时要用到的工具酶有；该实验病毒的作用是_____________。

（3）获取含重组基因的干细胞
基因转移的同源重组自然发生率极低（动物的重组概率为10-2～10-5），因此“同源性片段”含有的标记基因作用非常重要，可采用__________________技术检测或利用选择培养基筛选。

靶基因被插入同源性片段后发生基因突变，该特异性插入突变克服了自然诱发突变或人工物理、化学诱发突变的______________特点，便于专一性研究靶基因的功能。

（4）将重组的胚胎干细胞通过显微注射技术导入胚泡（囊胚中），然后将胚泡植入受体小鼠子宫中，获取子代嵌合体小鼠。

其中一些子代小鼠的配子不含无活性基因，原因可能是________________________________________（答出2点）。

X 代中含有无活性基因的雌鼠和雄鼠均为_________________。

（5）获取基因敲除纯合子小鼠
假设已获取1只雌性基因敲除杂合子小鼠。

用遗传图解表示利用该鼠通过杂交实验获得纯合基
因敲除小鼠的过程。

（靶基因用A 表示，插入同源片段的靶基因用A +表示 ）
答案（18分，除特殊说明每空2分）
⑴胰蛋白酶（1分） 调节pH （1分） 基因的选择性表达
⑵限制性内切酶、DNA 连接酶 （缺一不可） 载体
⑶ DNA 分子杂交 随机性和不定向性（1个1分）
⑷ 子代小鼠可能为杂合子； 重组胚胎干细胞未分化为精原细胞或卵原细胞
杂合子
⑸
2. RNA 干扰技术（RNA interference ，RNAi ）引起的基因敲除：
RNAi 是一种普遍的转录后基因沉默的机制。

由于少量的双链RNA 就能阻断基因的表达，并且这种效应可
以传递到子代细胞中,所以RNAi 的反应过程也可以用于基因敲除。

近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi 这种更为简单方便的方法。

3. 利用随机插入突变进行基因敲除
利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立
一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞。

根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同，逆转录病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言，
农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除。

( 1 ) T-DNA 简介及相关例题
T-DNA 也叫三螺旋DNA ，是指一种由三股ssDNA 旋转螺旋行成的一种特殊结构。

另外，T-DNA 也叫transferred DNA 。

是Ti 质粒上的片断，T －DNA 上有三套基因，其中两套基因分别控制
合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。

第三套基因合成冠瘿碱。

T-DNA 技术是构建突变体库，反向遗传学的突破性技术之一。

T-DNA 是农杆菌Ti(tumor inducing)或Ri(root inducing)质粒中的一段DNA 序列，可以从农杆菌中转移并
稳定整合到植物核基因组中。

农杆菌Ti(tumor inducing)或Ri(root inducing)质粒已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。

T-DNA 是Ti 质粒上的片断，包含三个重要的基因，当整合到宿主细胞（主要是双子叶植物）时分别诱发根瘤，opine 化合物的合成和抑制细胞分化。

Ti 质粒因为自身一些优点很适合作为导入外源基因的载体，而外基因就是整合到T-DNA 上的。

自交
P
♀AA + × AA♂ （1分） F 1 AA + AA （1分）
F 2 A +A + 2AA + AA （1分）
解析：因为只获取1只雌性基因敲除嵌合鼠，所以第一步不能自交；F 1获得多只雌、雄基因敲除嵌合鼠
一切基因工程载体都是由某种细菌质粒或病毒来充任， 而在众多的载体中目前仅有 Ti 质粒在转化植物受
体方面取得较多的成功。

所以 Ti 质粒是当前植物基因工程中最常用的载体系统。

农杆菌侵染植物后，Ti 质粒中的 T-DNA 区段脱离质粒而整合到受体植物的染色体上。

因此，如果把外源基因插入 T-DNA 中，就有可能携带进入受体植物并整合到染色体上。

例 题
1.（16分）
利用农杆菌转化法，将抗逆基因转入至拟南芥（2n=10）中，获得不同株系的拟南芥。

（1）从农杆菌中获得带有潮霉素抗性基因（H 基因）的Ti 质粒，将抗逆基因插入到Ti 质粒的 上，
因Ti 质粒上的此结构具有 的特点。

（2）为确定不同拟南芥株系导入的基因在染色体上的相对位置，科研人员筛选并通过自交获得转基因成功的4
个纯合株系：1、2、3、4，做了如下杂交实验。

①4个纯合株系植株分别与非转基因植株正、反交得F 1，F 1自交获得F 2。

F 2中抗潮霉素性状与不抗潮霉素
性状的植株比例为 ，表明每个株系的H 基因均位于一对同源染色体上的同一位点，但不
能确定4个株系的H 基因是否位于同一对同源染色体上。

②将上述4个纯合株系植株间进行配组形成6个杂交组合（1×2、1×3、1×4、2×3、2×4、3×4），每个组合
得F 1，F 1自交获得F 2。

a ．除2×4组合外，其它杂交组合F 2中抗潮霉素性状与不抗潮霉素性状的植株比例均为15:1，表明1、2、
3三个株系相比较，它们的H 基因位于 （同源染色体/非同源染色体）上。

b ．2×4组合F 2植株全表现抗潮霉素性状。

假设株系1中H 基因在染色体上的位置如图1所示，请推测株
系2中H 基因的位置和株系4中H 基因的两种可能的位置（在图2中标注，竖线代表染色体，横线代
表基因的位置）。

c ．根据上述实验推测，利用农杆菌转化法导入到拟南芥中的基因的插入位置是 （随机/固定）的。

（3）潮霉素抗性可作为转基因植株后代具有抗逆基因的初步判断指标。

实验中发现上述纯合株系自交后代的抗
逆比例未达到100%，可能的原因是 。

答案（16分）
（1）T-DNA 可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA 上 株系 2 株系1 H H 图2
株系4 （第一种可能位置） 株系4 （第二种可能位置）
图1
（2）①3:1
②a.非同源染色体
b.（4分）
c. 随机
（3）抗逆基因丢失或抗逆基因未表达（合理给分）
2.（18分）科研人员将T-DNA片段（T-DNA的区段带有潮霉素抗性基因）插入正常株（野生型）水稻愈伤组织单个染色体DNA中，导致被插入基因（PIN蛋白基因）发生突变，得到矮杆水稻（突变型）Q。

科研人员利用矮杆突变体Q进行自交得到F1：
（1）统计F1代植株的株高，并剪取其叶片在含选择培养基进行筛选，统计实验结果如下表。

潮霉素抗性
F1植株性状
矮杆正常株高
抗性258 0
非抗性0 85
据表分析，说明矮杆突变体性状是性性状，水稻的株高是由对等位基因控制的，判断依据是。

F1矮杆植株自交得到F2，F2中矮杆性状所占比例为。

（2）已有研究表明PIN蛋白与生长素的极性运输有关。

研究者据此推测T-DNA片段的插入导致（选“矮杆水稻”或“正常水稻”）PIN蛋白基因的表达量，从而造成生长素的极性运输水平下降，植株中出现矮杆性状。

（3）为验证上述推测，研究者首先需要从水稻叶片中提取总RNA，经过程获得cDNA；再根据PIN蛋白合成基因的设计引物，定量扩增PIN蛋白合成基因，得出样品中PIN蛋白合成基因转录出的mRNA 总量；最终比较PIN蛋白基因在正常水稻和矮杆水稻细胞内的表达量。

（4）为证明“PIN蛋白定位于植物细胞膜上”，研究者实验设计的核心步骤及预期实验结果是（填字母）。

a.PIN基因与绿色荧光蛋白基因融合与质粒构建重组DNA
图2
b.已知细胞膜蛋白基因与红色荧光蛋白基因融合构建重组DNA
c.用显微镜观察，细胞膜上仅出现红色荧光
d.用显微镜观察，细胞膜上仅出现绿色荧光
e.用显微镜观察，细胞膜上出现红色和绿色荧光
答案（18分，除标出的每空1分外，其余每空2分）
（1）潮霉素显—1分 1—1分 T2代矮杆：正常杆=3:1的分离比 5/6
（2）正常水稻下降
（3）逆转录碱基排列顺序
（4）abe
3.（22分）烟草是一种种植历史悠久的作物，可以采用不同方式进行育种。

（1）现有甲、乙两种烟草（2n=24），二者远缘杂交不亲和。

研究人员用甲、乙植株进行了体细胞杂交，将叶肉细胞去除细胞壁制成，在促融剂的诱导下，融合成为杂种细胞并最终培养成杂种植株。

在杂种植株中发现有一株体细胞染色体数目为47条的丙植株，将丙与甲植株进行杂交，F1中一些植株（丁）体细胞含有35条染色体，其中有22条染色体在减数分裂时能联会，其余不能联会，由此推测丙植株所缺失的染色体属于
（填“甲”或“乙”）植株。

如果所缺失的那条染色体属于另一植株，那么丁植株在减数分裂时应有条染色体能联会，其余条染色体不能联会。

（2）甘蔗的蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性直接反映了甘蔗体内蔗糖合成的能力。

研究人员将未突变和已突变的蔗糖磷酸合成酶基因分别转入烟草中，测定比较了所得SPS的活性，为作物的改良提供了一定的依据。

①甘蔗中控制SPS合成的基因简称SPS3L，研究人员利用特定的试剂和技术手段将SPS3L基因相关位点的碱基TCA 突变成CGA，从而使SPS的第153位丝氨酸变为丙氨酸，而其他氨基酸均无改变，此种突变基因称为SPS3L-A型。

由此推测在人工的处理下，SPS3L基因中的碱基可发生（填“定向”或“不定向”）改变。

另两种突变型（SPS3L-T型、SPS3L-G型）也用此方法获得。

②将目的基因与含有潮霉素抗性基因的Ti质粒构建基因表达载体，采用农杆菌转化法导入烟草细胞，利用技术进行培养。

培养基中除含有必要营养物质、植物激素和琼脂外，还必须加入进行筛选。

若要检测目的基因是否导入烟草细胞，可采用
技术或PCR技术进行检测。

③取上述已成功导入目的基因的新鲜烟草，分别测定叶片的可溶性糖含量，结果如图所示。

四种转基因烟草中，导入的是对照组，型的烟草叶片可溶性糖的含量与之相比没有发生明显变化，推测在153位的丝氨酸虽然被替代，但SPS的活性。

由测定结果可以看出型SPS活性最高，最适合用来改良作物。

答案（22分）
（1）原生质体聚乙二醇甲 24 11
（2）①定向②植物组织培养潮霉素 DNA分子杂交
③SPS3L SPS3L-G 没有改变 SPS3L-T
( 2 ) 转座子简介及相关例题
转座子是一类可移动的遗传因子，是指一段基因可以从原位上单独复制或断裂下来，然后插入另一位点，并对其后的基因起调控作用，此过程称转座。

这段序列称跳跃基因或转座子。

转座子在生物界具有普遍性，目前已经发现的转座因子包括插入序列（IS）、转座子（Tn）、转座质粒和转座噬菌体（Mu）等不同类型。

已知的转座因子的转座途径有两种：复制转座和非复制转座。

转座子参与许多重要的生理活动、表现出许多的遗传学效应，比如转座子能够引起插入突变、使插入位置上出现新基因、引发回复突变或染色体畸变、造成同源序列整合、促进基因组进化等等。

同时，作为一种工具或技术，转座子在基因工程、分子生物学、发育生物学、疾病预防等方面得到广泛的应用。

例题
1.转座子是一段可移动的DNA序列，这段DNA序列可以从原位上单独复制或断裂下来，插入另一位点。

转座子
可在真核细胞染色体内部和染色体间转移，在细菌的拟核DNA、质粒或噬菌体之间自行移动，有的转座子中含有抗生素抗性基因，可以很快地传播到其他细菌细胞。

下列推测错误
．．的是
A．转座子可以独立进行DNA复制B．转座子可造成染色体变异或基因重组
C．转座子可用于基因工程的研究D．细菌的抗药性均来自于自身的基因突变
答案：D
2.（18分）
金鱼草（二倍体）辐射对称花型（c650）基因与两侧对称花型（c）基因是一对等位基因；自交亲和（Sc）基因与自交不亲和(S)基因是一对等位基因。

c650基因比基因c多了Tam5转座子，Tam5转座子是可以从染色体所在位置转移到染色体其它位置的DNA片段。

相关基因与染色体的位置关系及基因部分结构，如图所示。

⑴将纯合辐射对称花型、自交亲和植株与纯合两侧对称花型、自交不亲和植株杂交得F1。

①F1花型为两侧对称，表明基因为隐性基因。

在基因不发生改变的情况下，F1植株花型的基因型为。

②采用技术对F1中的c650基因进行分子水平的检测，结果发现F1中有一半左右的植株中c650基因发生改变，此变异较一般情况下发生的自然突变频率，推测可能是的结果。

⑵从F1中选出基因型为ScS且c650基因未发生改变的植株进行异花粉得F2。

①若不考虑基因发生改变的情况，则F2中辐射对称花型所占比例应为。

②从F2的150个辐射对称花型植株中检测出5个植株含S基因，推测F1植株在时发生了基因重组。

③对上述5个植株的花型基因做检测，其中3个植株中的花型基因为杂合，表明这3个植株中产生了c650基因的基因，且此基因与c基因的碱基序列（相同/不同）。

④将上述F2中其余2个花型基因纯合的个体自交得F3，其中出现较高比例的花型的个体，显示这些个体中c650基因转变为c基因，表明F2中转座子仍具有转座活性。

⑶借助F2中得到的重组个体，并利用Tam5的转位特性，改变S基因的和功能，从而进一步研究S基因的作用机理。

答案（18 分）
（1）①c650 cc650 ②DNA 分子杂交 高 Tam5 发生转位
（2）①1/4 ②产生配子（减数分裂） ③等位基因 ④两侧对称
（3）结构
3.（18分）
玉米的籽粒颜色有紫色、白色和花斑之分。

为研究玉米籽粒颜色的遗传规律，科研人员进行了系列实验。

（1）用紫色籽粒玉米进行自交，偶然发现后代表现为紫色:花斑:白色＝12:3:1，据此推测：
①该玉米基因型为__________（用基因A 与a ，B 与b ，C 与c……表示）。

②花斑籽粒的基因型是____________。

对花斑籽粒进行测交，表现型及比例为____________。

③已知亲本紫色籽粒玉米为纯种，推测出现上述现象的原因为__________。

（举一例说明即可）
（2）多年后研究发现玉米籽粒花斑性状的出现与9号染色体上的C 基因、Ds 基因和Ac 基因有关。

玉米籽粒
不同颜色的形成机理如下图所示。

①花斑籽粒的出现受到_________基因调控，所以不同于一般的基因突变。

②白色籽粒的出现是由于该染色体上____________，导致C 基因被破坏。

③花斑籽粒中紫色斑点出现的原因是：种子形成过程中，______________。

紫色斑点的大小由____________决定。

（3）依据上述机理，利用Ac 和Ds （序列已知）特有的功能，可用于研究：____________。

答案（18分）
（1）① AaBb （合理即给分，如AaBbCC ）
② A_bb 或aaB_（合理即给分）
花斑:白色=2:1 ③ AABB （AAbb 或aaBB ）突变为AaBb
（2）① Ac 和Ds
② Ac 激活Ds ，使Ds“跳离”原位置并插入C 中，
③ 某些细胞中Ac 激活Ds 从C 基因处移走，C 基因表达，出现紫色
Ds 从C 基因上移走的早晚（产生紫色斑点的细胞分裂次数）
花斑籽粒
白色籽粒
紫色籽粒
Ac 激活Ds Ac 激活Ds
（3）被插入基因的功能（基因突变的位置；获取被插入基因）
4. 利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除
CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA 或其他外源DNA 的免疫机制。

在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。

目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。

在CRISPR/Cas9技术中，基因编辑的实现只需要两个工具----向导RNA（guide RNA, gRNA）和Cas9蛋白。

其中，向导RNA的设计并不是随机的，在编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（5’-NGG-3’,其中
N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。

以基因敲除为例，在被敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1和向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断
裂。

由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。

CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

CRISPR/Cas9技术敲除掉部分基因原理图
例题
1.（18分）研究者根据果蝇X染色体上红眼基因B设计出sgRNA，导入果蝇早期胚胎细胞，“敲除”部分胚胎细胞中的红眼基因B，得到镶嵌体果蝇（即复眼中部分小眼呈红色，部分小眼呈白色），如下表。

sgRNA浓度（ng/mL）不注射0 125 250 500 1000
胚胎存活率（%）16 11 8 6 7 3
镶嵌体果蝇比例（%）0 0 10 17 50 86
（1）由实验结果分析，sgRNA的导入___________了果蝇胚胎的存活率，若要从相同数量的早期胚胎中获得数量最多的镶嵌体果蝇，应选用的sgRNA最佳浓度为_______ng/mL。

（2）如图所示，敲除基因时，sgRNA与红眼基因B的部分序列互补配对，细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切，引起红眼基因B发生碱基对___________，导致基因突变。

该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用类似于___________酶的作用，敲除后需要___________酶对DNA上的切口进行修复。

（3）若研究者要通过测交实验验证镶嵌体雄果蝇的基因组成，应将镶嵌体雄果蝇与表现型为___________的果蝇进行杂交，预期杂交后代的表现型是___________。

（4）这种定点敲除基因的方法为艾滋病的治疗提供了一个思路。

HIV通过识别膜蛋白C侵入宿主细胞，研究者可以根据___________的核苷酸序列设计sgRNA，导入骨髓___________细胞中，有效阻止HIV侵染新分化生成的T淋巴细胞。

答案.（18分）
（1）降低500 （2）缺失限制（或“限制性核酸内切”）DNA连接
（3）白眼雌性红眼雌性、白眼雌性、白眼雄性
（4）膜蛋白C基因造血干（或“淋巴干”）
2.（18分）Vash2基因在肝癌、卵巢癌、乳腺癌等组织中表达程度较高，有促进肿瘤血管生成的作用。

为研究其具体作用机制，研究者应用Cas9/sgRNA系统构建了Vash2基因敲除的小鼠模型，该系统作用机理如下图所示。

（1）Cas9系统最早在细菌体内发现，是细菌用来抵御噬菌体DNA等外源DNA片段入侵而建立的机制，相当于人类的系统。

（2）为敲除Vash2基因，需要设计sgRNA（单链向导RNA），由图可知，sgRNA的一段序列能与Vash2基因。

研究者通过技术将sgRNA和Cas9mRNA导入小鼠受精卵。

在受精卵中，sgRNA可以引导由Cas9mRNA通过过程产生的Cas9酶在配对区域定点剪切，使Vash2基因片段________（填图中罗马数字）发生缺失从而导致基因突变。

（3）被敲除基因的鼠经胚胎移植，最后获得44只F0代小鼠，经PCR检测和基因测序，从中选出1号、3号、5号、39号为阳性高效敲除小鼠。

由于是随机敲除，导致不同个体丢失的基因片段大小不同，具体情况见下表。

编号敲除的总片段长度
（bp）敲除的有效片段长度
（bp）
1（♂）169 169
3（♂）196 196
5（♀）429 268
39（♀）483 200
尽管得到的四只小鼠都是纯合子，但由于丢失片段不同，通常F0代小鼠之间不能相互交配。

为了得到能稳定传代的Vash2基因敲除纯合子，研究者从上表中选择5号小鼠和鼠交配，得到F1代Vash2杂合子。

选择5号小鼠的原因是：。

（4）F1代小鼠相互交配得到F2代，将F2代小鼠进行Vash2 基因PCR电泳检测，结果如右图所示。