《分子生物学实验》教学大纲

《分子生物学实验》教学大纲

一、课程基本信息

课程编码：091118B

课程名称：分子生物学实验

英文名称：experiment of molecular biology

课程类别：专业必修课

总学时：24

总学分：1

适用专业：生物科学

二、实验课程的性质、目标与任务

1. 分子生物学已成为生命科学的基础学科之一，其基本理论和实验技术已渗透到生物学的各个领域并促进了一批新学科的兴起和发展。目前，以分子生物学为基础的基因克隆重组技术已成为现代生物技术的核心。因此，在掌握基本分子生物学理论的基础上，为培养学生在分子生物学技术方面的实际动手能力，开设本实验课程。

2. 目标：通过实验原理的讲解和实验操作，使学生初步了解和熟悉现代分子生物学实验的基本原理、操作技能和实际应用，提高学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力。

3. 通过本课程的实验教学和实验操作，要求学生熟练掌握下列分子生物学实验技术：大肠杆菌感受态细胞的制备和转化，质粒DNA的分离及纯化，琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增，DNA重组、转化与检测实验等。

三、实验课程教学基本要求

（1）注重分子生物学基础实验技能的掌握与提高，提升学生的动手操作能力；

（2）实验课前要预习，明确每次实验的目的、原理与基本步骤；

（3）实验过程中要具有严谨科学的态度，尊重事实与实验结果，要善于发现问题、分析问题、解决问题；

（4）树立学生之间的交流与合作意识。

四、实验教学内容及要求

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备

【实验类型】

基础性实验

【目的与要求】

掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术。注意严格无菌操作，在冰上进行。正确选取对数生长期的大肠杆菌细胞。

【内容提要】

感受态是细菌处在容易吸收外源DNA的状态。选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌DH5a菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。实验操作步骤：

1.挑取单菌落，接种培养过夜

2.转接培养

3.将菌液置冰浴处理

4.收集菌体

5.CaCl2处理，-70℃保存。

【所需主要仪器设备】

1.超净工作台

2.低温离心机

3.恒温摇床

4.紫外分光光度仪

实验二质粒DNA的转化

【实验类型】

基础性实验

【目的与要求】

掌握质粒DNA的转化技术。注意严格无菌操作，在冰上进行。准确控制转化热激的温度和时间。

【内容提要】

DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理可以促进DNA的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Amp r）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。实验操作步骤：

1. 取新鲜制备的感受态细胞，加入质粒；同时做一对照试验

2. 42℃水浴热激

3.冰浴

4.复苏

5.涂平板

6.菌落培养

【所需主要仪器设备】

1.超净工作台

2.恒温水浴

3.恒温摇床

实验三质粒DNA的提取

【实验类型】

基础性实验

【目的与要求】

碱裂解法提取质粒的技术和方法。注意加入三种溶液的先后顺序，在提取过程中，动作要轻柔。

【内容提要】

碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低至中性后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。实验操作步骤：

1. 收集菌体

2. 加入三种溶液

3. 离心

4. 质粒的纯化

5. 质粒的保存

【所需主要仪器设备】

1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．小型高速离心机 4．漩涡混合器

实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA

【实验类型】

基础性实验

【目的与要求】

掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术与方法。注意观察DNA的分子量大小，估计DNA的含量，推测出样品DNA的浓度，观察质粒的3种构型，分析质粒DNA的质量，判断可否作为下一步基因重组的材料？

【内容提要】

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段的泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子（以质粒为例，一般情况下迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环）。实验操作步骤：

1. 制备琼脂糖凝胶板

2. 加样电泳

3. 拍照

【所需主要仪器设备】

1.琼脂糖凝胶电泳系统

2. 凝胶成像系统

实验五 PCR基因扩增

【实验类型】

基础性实验

【目的与要求】

掌握PCR反应的基本原理和实验技术。注意确定好退火温度和延伸时间。

【内容提要】

PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板互补的子链DNA 的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控等许多方面。实验基本操作步骤：

1. 变性