极性C18-亲水作用色谱-强极性化合物分离专题-2013

亲水作用色谱应用 亲水作用色谱影响因素及应用

血浆中叶酸化合物的检测
Nest Group HILIC column，乙腈/水（75：25）5mM乙酸铵，pH 6.9 S.D.Garbis，Anal. Chem. 73（2001）5358

单糖、寡糖分离
亲水作用色谱影响因素及应用
单糖、二糖分离 氰基柱 乙腈/水/甲酸铵 (240 mM, pH 3.0) 76:23:1
强极性小分子分析解决方案
碱性化合物拖尾的原因，残余硅醇基与碱性化合物作用造成拖尾
针对碱性化合物，研发出专用碱性化合物的分离分析的色谱柱 XCharge 系列
设计理念：合理控制电荷密度， 形成恰当的电荷屏蔽层，消除硅 醇基的拖尾影响，实现载样量的 提升。
强极性小分子分析解决方案
羟氨苄青霉素
色谱条件： 色谱柱：XCharge C18； 流动相：A 0.1%甲酸水，B0.1%甲酸甲醇； 梯度：0~20 min，5%B~95%B
亲水作用色谱特点
亲水作用色谱机理及特点
反相液相色谱 正相液相色谱 HILIC
离子对色谱
好的保留 好的溶解度
强极性组分 流动相简单
毛细管电色谱
大的制备规模
亲水作用色谱影响因素
亲水作用色谱影响因素及应用
固 定 相
有 机 溶 剂 缓 冲 盐 pH
柱 温

固定相对亲水模式分离的影响
亲水作用色谱影响因素及应用

有机溶剂对亲水模式分离的影响
亲水作用色谱影响因素及应用
TSKgel Amide-80
YMC-Pack NH2
aspirin
HILIC Silica
× ZIC-HILIC
5mM ammonium acetate， 30℃
cytosine
Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71
强极性小分子分析解决方案
增加保留
与反相不同保留机理正交性
更好的溶解度和质谱兼容性
强极性小分子分析解决方案
甘露醇
15.168
100.00
山梨醇
80.00
色谱柱：XAmino，250 mm ×4.6 mm，
5 mm
流动相：A:乙腈
B：水 等度：A/B = 85:15
60.00
LSU
40.00
流速：1.0 mL/min 柱温：35 oC
vancomycin
TSK Gel Amide 80 column 0-40min， ACN：90-75%；0-80min，ACN：75%
M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439

pH对亲水模式分离的影响
亲水作用色谱影响因素及应用
Retention of BTEAC as a function of pH
强极性小分子分析解决方案
样品1
拖尾
XAqua C18
100%甲酸水
保留好， 分离好
S-Click XIon 乙腈甲酸铵体系
样品为某 CRO公司 提供合成中 间体小分子 化合物
不保留 XCharge C18 100%甲酸水 放大图
强极性小分子分析解决方案
样品2
分离度差 XAqua C18 乙腈甲酸水 主峰纯度 96.55% 保留适中分 离度良好 S-Click XIon 乙腈甲酸水 主峰纯度 84.91%
亲水色谱固定相
( 1) 传统的正相色谱固定相，包括纯硅胶固定相、氨基键合相
、二醇基键合相、氰基固定相。该类固定相对糖、有机酸、
核苷等强极性化合物表现出良好的分离选择性; ( 2) 离子交换固定相，该类固定相具有很好的亲水性，表面带 有较强的表面电荷，用于亲水作用色谱时表现为一种离子交 换( 或排斥) /亲水作用混合色谱模式; ( 3) 专门应用于亲水作用色谱的固定相，包括酰胺类固定相、 醇羟基固定相和两性离子固定相。酰胺类固定相可用于分离 核苷、核苷酸、肽、糖、糖醇及有机酸等亲水化合物; 醇羟

柱温对亲水模式分离的影响
亲水作用色谱影响因素及应用
TSKgel Amide-80
aspirin
YMC-Pack NH2 HILIC Silica × ZIC-HILIC
ACN/water: 90/10 (10mM ammonium acetate)
cytosine
Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71
专题讲座
极性小分子分离分析
1
强极性小分子分析难点
1.我的样品是两性极性小分子化合物，反相柱不保留，怎样选择合适 的色谱柱分析。 关键词：不保留 2.我的样品分析条件比较特殊，必须要进行质谱检测，要选择可以进 质谱的分析条件。 关键词：质谱兼容
强极性小分子分析难点
一般极性化合物 中强极性化合物
强极性化合物
5
3 0
70
m in
川芎强极性成分反相模式分离，UV检测（260nm）
亲水作用色谱保留机理
亲水作用色谱机理及特点
分配
极性固定相
富水层
吸附
流动相
极性固定相
溶质
A. J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177. Y. Guo, J. Pharm. Biomed. Anal. 31（2003）1191 T.Yoshida, J. Biochem. Biophys. Meth. 60（2004）265 Y. Guo, J. Chromatogr. A 1074（2005）71
基固定相适合于分离各种糖，如单糖、二糖、糖醇、寡糖及
碱基、核苷、肽和中药中的强极性组分。
亲水作用色谱机理及特点
强极性化合物反相模式分离
ODS Column 1.000mL/min A: 0.1% 甲酸/水 B: 乙腈
m AU 500
时间/分钟
0
3 0
50
B/%
400 300 200 100 0 0 10 20 30 40
流动相：100%（0.1%三氟乙酸水）
强极性小分子分析解决方案
中性或酸性极 性小分子化合物
XAqua 系列
★解决
拖尾
碱性极性小 分子化合物
质谱不兼容
XAqua 系列
一般解 流动相中加入 决办法
0.5 0.4 0.3
离子对试剂
Au
0.2 0.1 0.0 0 5 10 15 20
Retention Time/min

有机溶剂对亲水模式分离的影响
亲水作用色谱影响因素及应用
(1) epidaunorubicin, (2) daunorubicin, (3) epirubicin, (4) doxorubicin Kromasil KR100-5SIL 10% HCOONa buffer (20 mM, pH 2.9) R. P. Li, J. Chromatogr. A, 1041 (2004) 163
AU
0.20 0.00 5.00
10.00
15.00 分钟
20.00
25.00
30.00
专题讲座
亲水作用色谱与中药中强极性化合 物的分离
22
主要内容
亲水作用色谱保留机理及特点 亲水作用色谱影响因素及应用 中药中强极性化合物的分离 研究方向
亲水作用色谱机理及特点
反相色谱
强极性化合物的分离
亲水作用色谱
强极性小分子分析解决方案
停流实验
强极性小分子分析解决方案

原儿茶醛
色谱条件：
5mm) 流动相：乙腈：1%醋酸水溶液=5:95； 柱温：30°C; 流速:1.0 mL/min;
色谱柱：XAqua C18(150 × 4.6 mm，
强极性小分子分析解决方案
小分子酸
色谱条件： 色谱柱：XAqua C18；
麦芽寡糖分离 氨基柱 乙腈/水/甲酸铵 (240 mM, pH 3.0) 70:29:1
A. H. Que， Anal. Chem. 74（2004）5184
亲水作用色谱影响因素及应用

糖基磷脂酰肌醇锚蛋白（GPI-APs）分离
MALDI-TOF mass spectra of peptides from MDP tryptic digest
强极性小分子分析解决方案
利用极性共聚技术研发出耐水的XAqua 系列色谱柱
一步法反应 较好保持了烷基链的疏水性
可调的极性基团种类和数量 增加了材料的稳定性
破坏了烷基 链的疏水性 两步反应，极性 基团数量不可控
Polar-copolymerized 极性共聚
Polar-embeded Polar-endcapped 极性包埋 极性封尾
强极性小分子分析解决方案
磺胺类碱 性小分子
色谱条件：
色谱柱：XCharge C18； B乙腈； 梯度：0~30 min， 5%B~95%B
流动相：A 0.1%甲酸水，
强极性小分子分析解决方案
XAqua C18
超强极性怎么办，反
相纯水条件下不保留
流动相：100%水
HILIC 模式
XAmide 流动相：85%乙腈水
选择性：1.12 分离度：3.08
20.00
0.00
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00 分钟
12.00
14.00
16.00
16.850
18.00
20.00
22.00
强极性小分子分析解决方案
左旋肉碱
色谱柱：XAmide，250 mm ×
4.6 mm，5 mm
流动相：A: 磷酸盐缓冲液 B：
乙腈
等度：A/B = 30:70
流速：1.0 mL/min 柱温：35 oC
强极性小分子分析解决方案
未知极性小 分子化合物
XAqua C18
拖 尾
XCharge C18
不 保 留
XAmide
拖 尾
S-Click XIon
反相模式
亲水模式
方案特点
1.该方案基本适用于所有极性小分子化合物，普试性好。 2.该方案所有流动相都可应用于质谱，质谱兼容性好。 3.采用两种模式，增加了样品的选择性。
普通反相模式 C18/C8可解决
部分化合物在 纯水条件下反 相模式解决 问题：疏水塌陷
在反相上无保 留，正相不溶 解，难点
问题：不保留，不溶解
强极性小分子分析解决方案
C18 甲醇中 C18 水中
强极性小分子分析解决方案
避免疏水塌陷的几个策略
选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾
对烷基链固定相进行极性基团嵌入的改造 选用短链烷基键合相且不对硅醇基封尾 选用链长更长的烷基固定相 选用大孔硅胶

缓冲盐对亲水模式分离的影响
亲水作用色谱影响因素及应用
A: 6.5mM 三氟乙酸； B: 7.9mM 甲酸铵 pH 4.4 C: 6.5mM 乙酸铵 pH 5.5； D: 6.3mM 碳酸氢铵 pH 7.9
terreic acid oosporein guanine
nocardicin A cephalosporin C
Analysis of test solutes on Atlantis silica
Atlantis silica 85% ACN-0.1M NH3 pH adjusted with formic acid
源自文库
ACN–0.1M HCOONH4, pH 8.2–10.2
D.V. McCalley J. Chromatogr. A 1171（2007）46
HILIC
正相色谱
溶解度 与质谱联用 A.J. Alpert, J. Chromatogr., 499 (1990) 177.
亲水作用色谱
亲水作用色谱法的分离原理与正相色谱法相近的极性固定
相、以高比例极性有机溶剂和低比例水的混合溶液为流动相，
主要用于极性化合物的分离。被分析物质在色谱柱中的保留和 其自身的极性成正比，和流动相的极性成反比。被分析物质的 极性越强，在色谱柱中保留越强。增加流动相中水的比例，使 流动相极性增强，则分析物保留减弱。
terreic acid oosporein guanine nocardicin A cephalosporin C vancomycin
(A) Keystone Carbohydrate, (B) Asahipak NH2P, (C) BetaBasic Cyano, (D) Metasil Cyano, (E) TSKGel Amide-80, (F) Cyclobond III, (G) Polyhydroxyethyl Aspartamide 0-40min， ACN：90-75%；40-80min，ACN：75% M. A. Strege, Anal. Chem. 70 (1998) 2439
（A）HILIC eluate； （B）PNGase F-treated HILIC eluate
样品为某 CRO公司 提供合成中 间体小分子 化合物
强极性小分子分析解决方案
样品3
样品为某 CRO公司 提供合成中 间体小分子 化合物 分离度差 XAqua C18 100%甲酸水 主峰纯度 96.55% 保留适中 分离度良 好 保留弱 分离度差
1.00 0.80 0.60
0.40
XCharge C18 100%甲酸水 主峰纯度 96.55%