核酸检测技术及质量控制(王凤鸣)
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生物安全的概念
实验室生物安全
避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室 外扩散并导致危害的综合措施。
生物安全三个方面:
一指人类的健康安全;二指人类赖以生存的农业生 物安全;三指与人类生存有关的环境生物安全。
微生物实验室生物安全
三项技术措施
样品隔离技术(机械、气幕):防止传染因子进 入环境接触人体
5.排气处理方式
BSL实验室:不允许室内 → 室外; 排气须净化,不许回风。
生物洁净室:一般室内 → 室外; 排气可回风。
6.实验室软、硬件的作用
BSL实验室:对工作人员保护,实验室软件应是决定性的; 对环境保护,实验室硬件应是决定性的; 生物洁净室:均很重要,但硬件设施作用比较大。
与一般生物洁净室的区别
3) 实验室各表面平整、易清洁、不渗水、耐腐蚀。
4) 实验台面防水,耐腐蚀、耐热。
5) 橱柜和实验台牢固,保持一定距离以便于清洁。
6) 实验室可以利用自然通风。如果采用机械通风,应
避免交叉污染。
BSL-1实验室
7) 如有可开启的窗户,应设置纱窗。 8) 保证工作照明,避免不必要的反光和强光。
9) 有适当的消毒设备。
定向气流技术(负压系统):防止传染因子扩散 消毒灭菌技术(物理、化学):灭活传染因子
实验室可以分为
基础实验室 —— 一级生物安全水平 基础实验室 —— 二级生物安全水平 防护实验室 —— 三级生物安全水平 最高防护实验室 —— 四级生物安全水平 根据操作不同危险度等级微生物所需的实验室设计
Class II 生物安全柜
生物安全柜摆放位置
① 与其它操作区域相分离; ② 远离主要通道; ③ 与气道有 一定距离; ④ 与实验室入口保持一定距离。
李燕
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生物安全柜的使用
理想的工作台摆放
被污染的区域 干净的物品 垃圾袋 废弃物托盘
个人防护装备
实验室防护服 面部及身体保护 手套 鞋(套) 呼吸防护
核酸检测技术及质量控制
常州市疾病预防控制中心
王凤鸣
目
录
一、PCR实验技术操作要点 二、质量控制要点
三、实验室生物安全管理
一、PCR实验技术操作要点
常用仪器设备
加样器
PCR实验室应备有4套 连续可调加样器,分 别用于试剂准备、样
本处理、扩增和产物
检测四个试验区。
加样器的类型
单道连续可调式移液器
1.工作目的
BSL实验室: 保护工作人员和环境为主,也保护产品。 安全是首要考虑因素。
生物洁净室:以保护产品(工作对象)为主。洁净是首 要考虑因素
2.污染物的种类和来源
BSL实验室:为目标微生物。内部产生。
生物洁净室:粉尘(可能的热源)和微生物。外部进入 以及人的活动产生。
与一般生物洁净室的区别
3.空气污染物处理方式
高速(冷冻)离心机-使用方法
机体应始终处于水平位置,外接电源系统的电压要匹
配,并要求有良好的接地线。
开机前应检查转头按装是否牢固,机腔有无异物掉入。 离心机运行时,离心机周围30cm范围内不能有人和危 险物品。 挥发性或腐蚀性液体离心时,应使用带盖的离心管, 并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。
三、实验室生物安全管理
为什么关注实验室生物安全?
三起SARS疫情后期的实验室感染事件
2003年9月8日:新加坡国立大学实验室,在P3实验室
同时开展西尼罗病毒与SARS病毒的研究,一位27岁华人研 究员感染;
2003年12月6日:台湾省国防大学预防医学研究所,一
名47岁的中校研究员,在P3实验室内清理SARS实验后的废 弃物时,未戴手套,因而感染;
吸取液体时应缓慢匀速吸取,避免液体溅到移
液器头上;打出液体后拇指不应松开按钮,将 吸液嘴压掉后再将拇指松开,避免液体回吸。
在调整取液量的旋钮时,不要用力过猛,并应
注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。
连续可调式移液器不可在无吸头时使用,吸头
有液体时不可平放或倒置。
(一)高速(冷冻)离心机
多通道连续可调式移液器
单道连续移液器
单道移液管配合使用的移液器
加样器的使用
加样器的校准
校准方式 计量局 厂家 自较 时间 视使用频率定(6个月-1年)
加样器-注意事项
根据所需取液量选择相应的移液器及吸头,基因扩增实 验要求使用带滤芯的吸头,防止交叉污染。
加样器-注意事项
缓冲间
工作流向
理想的PCR实验室分区设计模式
标本处理与核酸提取的质量控制
核酸提取试剂的选择 核酸扩增试剂的选择 试剂的分装保存 试剂的配置 对照的设立 核酸扩增仪器 扩增参数的设定
扩增产物的检测与分析 荧光定量 普通凝胶电泳 毛细管电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
污染的控制和预防
常见污染的来源 控制污染的措施 消除污染的措施
分子生物学实验室的质量控制涉及到 整个基因检测扩增的所有阶段,确保检 测结果的准确性和可靠性,严禁各类交 叉污染事故的发生。
PCR实验技术的质量控制要点
PCR实验的过程主要包括:
标本处理与核酸提取 扩增试剂的准备 核酸扩增与产物分析 测定后的结果报告
PCR实验技术的质量控制要点
高质量无污染无降解的核酸制备
电机 转速 最低转速 最高转速 转头 消毒方式 标准配件系统 噪音
高速(冷冻)离心机-使用方法
离心机应放置在水平坚固的地板或平台上,并力求使机器 处于水平位置以免离心时造成机器震动。 打开电源开关,按要求装上所需的转头,将预先平衡好的 样品放置于转头样品架上,关闭机盖。
按功能选择键,设置各项要求:温度、速度、时间、加速 度及减速度,带电脑控制的机器还需按储存键,以便记忆 输入的各项信息。 待离心机完全停止转动时打开机盖,取出离心样品,用柔 软干净的布擦净转头和机腔内壁,待离心机腔内温度与室 温平衡后方可盖上机盖。
反应条件设置 1份样品的量
2.875ul 6.25ul 0.125ul 0.25ul
程序 循环数 温度 反应时间 1 2 3 1 1 45 50 95 95 30min 15min 15sec
60
1min
0.25ul
典型荧光定量PCR结果
阳性标本扩增曲线
阴性标本扩增曲线
二、质量控制要点
PCR实验技术的质量控制要点
特点、建筑构造、防护设施、仪器、操作以及操作
程序来决定实验室的生物安全水平。
实验室生物安全防护屏障
一级防 护屏障
生物安 全柜和 个人防 护装备 等构成 的防护 屏障。
生物安全柜
高效空气过滤器
。
实验室生物安全防护屏障
二级防护屏障
设施结构和通风系统等构成的 防护屏障。
“盒中盒”的结构
李燕
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实验室生物安全防护水平分级
生物安全水平分级
根据生物因子危害程度和采取的防护措施,将
生物安全防护水平(biosafety level,BSL)
分为4级(BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示);
动物实验室以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-
4表示。
与一般生物洁净室的区别
BSL实验室:平面布局和气流流向的作用, 产生环节在一 级屏障内进行个体防护。
生物洁净室:主要通过进气净化 减少活动。
4.洁、污概念
BSL实验室:凡有目标微生物即视为污; 凡无目标微生物即视为洁; 对各环节洁、污应仔细分析。 生物洁净室:粉尘、微生物(特别是超标者)和废弃物均 视为污。
与一般生物洁净室的区别
全自动核酸提取仪
全自动核酸提取仪
基于核酸的分子诊断技术
荧光定量PCR检测
DNA
病 毒 颗 粒 裂解 加 样 RNA
FQ-PCR
荧光信号检测
RT-FQ PCR
核酸提取
荧光PCR检测系统
病毒荧光定量PCR反应
反应体系配置 内容
DEPC H2O Master MIX RT-MIX 引物 探针 对照设置: 阴性对照:灭菌双蒸水代替标本 阳性对照:提取好的阳性核酸标本
2004年4月22日:中国CDC病毒所,跨室开展SARS病毒
研究,并引发三代、9例 病例、1例死亡;另有两例 “隐 性”感染者。
引起实验室生物污染的原因很多很多
人员生物安全概念薄弱和技术操作不当;
生物安全柜和高压灭菌容器的不正常使用或使用
不当; 样品传递、接受和使用、装有冻干感染性物质安 瓿的打开; 匀浆器、组织研磨器、摇床、搅拌器和超声处理 器的使用; 离心机内装有潜在感染性物质的离心管发生破裂
5) 应在操作病原微生物的实验间内配备生物安全柜。
6) 应有可靠的电力供应。
BSL-2实验室
生物危害警告标志。
典型的二级生物 安全水平实验室
生物安全柜
生物安全柜的要求:
颗粒经HEPA过滤去除 气流为层流 气流有方向
生物安全柜的分级
I级生物安全柜:保护 工作人员和环境 II级生物安全柜:保护 工作人员、环境和试样 (产品) III级生物安全柜:采 用手套箱更严格地保护 工作人员、环境和试样 (产品)
高速(冷冻)离心机-使用方法
易燃易爆以及易与其他物质发生反应的物质不能 离心。 在没有相应的防护措施时,不能离心有毒的、放 射性的物质或病原微生物。
离心机运行时不可人为地打开盖子。
如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹,则 应立即停止使用。 使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力 并大小合适。非金属转头不可用紫外照射。
7.压力递增方向
BSL实验室:缓冲室<准备室<主实验室 生物洁净室:缓冲室>准备室>主洁净室
生物安全柜与洁净工作台的区别
保护对象
操作区 压力
气体排 放方式
设备 结构
设备 造价
生物安全柜
操作者、
样品、环境
负压
净化后排放
复杂
较贵
洁净工作台
样品
正压
直接排放
简单
便宜
BSL-1实验室
1) 实验室的门应有可视窗并可锁闭。 2) 实验室门口设挂衣装置,个人便装与工作服分开。
【尾 声】
谢 谢!
严格实行分区操作
试剂储存和准备区
标本处理和核酸制备区
核酸扩增区 扩增产物分析区
实验人员的操作技能
PCR实验室设计的一般原则
各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作
产物分析区 扩增区 空气流向 空气流向 专用走廊
“十六字口诀”
标本制备区 空气流向
试剂准备区 空气流向
缓冲间
缓冲间
10) 若操作有毒、刺激性、放射性挥发物质,应在风 险评估的基础上,配备适当的负压排风柜。 11) 应设应急照明装置;应有足够的电力供应。 12) 应有防止节肢动物和啮齿动物进入的措施。
典型的一级生物 安全水平实验室
BSL-2实验室
1) 满足BSL-1的要求。 2) 实验室门可自动关闭,门禁系统。 3) 应在实验室工作区配备洗眼装置。 4) 应在实验室或其所在的建筑内配备高压蒸汽灭菌器 或其他适当的消毒灭菌设备。