第5章 亲和层析

第5章 亲和层析

一、亲和层析的特点：①待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，通过一次性操作即可得到较高纯度的分离物质。②具有浓缩作用，可以从含量很低的溶液中得到高浓度的样品，有的纯化倍数达几千倍。③利用生物学的特异性进行分离，所以分离条件比较温和，能够很好地保持样品原有的生物学性质。

二、基本原理：生物大分子的识别功能：①酶：底物、抑制剂底物类物；②抗体：抗原、病毒细胞；③激素：受体；④外源凝集素：糖蛋白、表面受体蛋白；⑤核酸：互补碱基链段、组蛋白。

1 配基：亲和层析介质的配基有很多，归纳起来主要有以下几类：

①有机小分子类主要有苯基类、烷基类、氨基酸类、核苷酸类等。②生物大分子类主要有酶类、抑制剂类、蛋白质、抗原抗体类等。③染料主要有蓝色葡聚糖、荧光染料等。

2 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。

3 活化剂：（最常用的几种活化剂）溴化氰(CNBr)、环氧氯丙烷、1，4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐等。

三、亲和层析介质的制备：

1 配基的选择（配基必备条件）：①能与活化剂的活化基团发生偶联作用，偶联后不影响配基和目标分子的专一结合特性。②专一亲和性要强，能有效地分离目标分子。③配基与目标分子结合后，在一定条件下能够被解吸附，且不破坏目标分子的生物活性。④在分离过程中配基与目标分子无空间阻碍。常用的配基：①酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅因子（辅酶、金属离子等）；②抗体----抗原、病毒、细胞、激素、维生素----受体蛋白、载体蛋白；③外源凝集素----多糖化合物、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；④核酸----互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合物、核酸结合蛋白。

2 载体的选择（理想载体的特性）：①不溶于水，但具有高度亲水性。②具有多孔网状结构和良好的流动性和渗透性。③机械性能良好，在一定静水压下不变形。④有足够数量的化学基团与大量的配基相偶联。⑤化学惰性，无或微弱的非特异性吸附作用。⑥有良好的物理和化学的稳定性。常用的载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。凝胶类载体的特点：①凝胶介质上的羟基容易被多种活化剂活化，引入不同的基团。②具有大孔性和亲水性，凝胶内部的羟基得到活化，有较高的活化效率。③刚性较好，珠状结构对流动向的阻力最小，分离效率

高。④非特异吸附极低，理化性质较稳定。

理化性质稳定性的要求：①在较广的pH范围内正常工作；②对去污剂、解离试剂保持稳定；③用0.1mol／L NaOH或0.1mol／L HCl处理2～3h不引起凝胶颗粒的变化；④不被乙醇、丙酮等有机试剂所破坏；⑤能耐受6mol／L盐酸胍或7 mol／L尿素处理；⑥吸附剂能够再生并重复使用。

3 活化剂的选择与偶联反应：（1）以生物大分子为配基的偶联反应：

①溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应

②环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应

（2）活化载体“接臂”：

①短臂(未接臂)亲和介质

②长臂(接臂)亲和介质

4 封闭：①在弱碱性pH下过夜或在Tris—HCl缓冲液(pH8)中2h被水解。②加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团。③封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露糖等。

5 亲和介质的技术指标：①配基偶联量(μmol／g 或μmol／ml)。

②样品吸附量(mg／s或mg／ml)。③化学稳定性抗氧化物，配基不降解。④耐酸碱如pH3～10。

三、亲和层析实验操作：（1）亲和层析实验流程：亲和层析介质——预处理——装柱、平衡与上样品——洗去未吸附杂质——洗脱、收集洗脱峰。（2）吸附条件的选择：①层析柱（吸附容量、待分离物质的总量）；②平衡缓冲液（pH和pI、上样体积、温度和流速等因素）；

③多次吸附，使纯化对象与配基充分作用。（3）洗脱条件的选择：①竞争性洗脱；②离子强度洗脱；③pH+离子强度洗脱；④变性剂洗脱；

⑤化学断裂。（4）洗脱方式：①一步洗脱：非选择性洗脱；②分步洗脱：选择性洗脱；③梯度洗脱：选择性洗脱，洗脱液浓度梯度变化。（5）亲和介质的处理：①0.5—1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性较强的杂质。②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。③6 mol／L

脲处理，除去中性分子杂质。④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。（6）亲和层析介质的保存：亲和层析介质一般保存于溶胀状态，保存温度4～8℃，不可冷冻，否则会破坏凝胶的珠状结构。在保存溶液中加入20％的乙醇或0．02％的硫柳汞以防止长菌。活化的rhiol-Sepharose 4B或thiopropyl-Sepharose 6B带巯基的介质不能用硫柳汞。

四、影响亲和层析的主要因素：①样液体积的影响；②流速的影响；③柱长的影响；④温度的影响。

五、应用实例：（1）GSH-Sepharose 4B亲和层析分离谷胱甘肽转硫酶；（2）CHOM-Sepharose 4B亲和层析分离胰蛋白酶。