罗氏实时荧光定量PCR仪分解

光学倍增管
Lightcycler 2.0 结构分析
空气加热系统
PMT 检 测 系 统
LED激发光源
光 纤
热力学结构
特点： 1、空气加热 2、毛细管反应体系 优点: 1、升降温速度快（0.05 ℃ -20℃/秒）， 2、体系均一，不存在边缘现象 3、把反应体系缩小到0-20ul，节省试剂成本 实现快速PCR
分子信标（Molecular Beacon Probe）
独特的颈环结构，由非特异的颈和特异的环组成， 探针的5’端标记荧光分子，3’端 标记一个吸收或淬灭 荧光的分子 。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR 反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5’ 端荧光分子与3’端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器 就会检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产 物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增 强来计算PCR扩增产物的增加量。
光学结构
特点： 1、免维护的LED冷光源，寿命长达2万小时以上 2、光学倍增管（Rodenstock ） 3、多达6通道（LC2.0）和3通道（LC1.5）实时检 测 优点： 1、毛细管光学特性将光线散射、衍射降至最低， 避免LED 功率低的问题 2、免维护，带自动检验功能 3、轻易实现内标、内对照及多重PCR
Standard Calculated concentration 1.0E+1 9.522E+9 0 1.024E+9 1.0E+9 9.433E+7 1.0E+8 1.127E+7 1.0E+7 1.029E+6 1.0E+6 9.902E+4 1.0E+5 1.021E+4 1.0E+4 9.217E+2 1.0E+3 9.276E+1 1.0E+2 1.085E+1 1.0E+1 H2O H2O
PCR领域最聪明的革新 – LightCycler荧光定量PCR
系统

超高速 实时在线监测 高灵敏 范围广 开放性 六个荧光通道 最小化 灵活性 闭管分析
30至40分钟完成PCR过程 收集每一循环的数据并立即显示于联机电脑上 在一个基因组当量中可检测出单基因拷贝 可检测10－1010拷贝线性范围，无需稀释样品 全开放，成为国内外试剂厂家的首选开发平台 轻易实现内标、内对照或多重PCR 定量反应体积降至10－20ul，费用低廉 支持水解探针、杂交探针及 SYBR Green I 消除污染风险
Lightcycler 的分析模式
适用于所有的通用探针及染料分析模式： SYBR Green I（荧光染料） TaqMan（水解探针） Molecular beacon（分子信标）

Lightcycler上开发独有的分析模式： Hybridization Probe Format（杂交探针） SimpleProbe （单探针）
光学性好，反应体系小，节约试剂成本,适合 多种用途。
反应体系
检测光路范围
530nm, 555nm, 610nm, 640nm, 六个波长，并解决相关荧光素荧光干扰问题 670nm, 710nm.
LightCycler 软件 4.0

更先进的自动定量方法
全新的相对定量软件
全自动熔点曲线分组 全自动熔点温度提示 简化数据和用户管理

研究组织或培养细胞中mRNA的表达水平

DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究
基因分型及SNP分析 转基因动物及植物研究
重点问题说明
超高速的热循环 ——由于采用空气迅速改变温 度，以及利用有高表面积/体积比的光学玻璃毛 细管模式，使升降温速度最高可达20℃/秒，温 控≤0.2 ℃ ， 每20～30分钟便能完成30～40个 循环。
水解探针（Taqman ）检测模式
同时标记有荧光发光分子和荧光淬灭分子的一条 探针在激发光作用下，发光分子所产生的荧光可被淬 灭分子吸收，因而检测不到荧光。在PCR延伸时，因 Taq酶具有的5，－3，核酸外切酶活性，可降解荧光探 针，使荧光发光分子与荧光淬灭分子分开，在外界光 源激发下即可发出荧光，荧光强度与PCR扩增产物量 有关。
光学玻璃毛细管的材料适合荧光讯号的测定，类似光纤 的形状，保证荧光讯号的准确捕获。没有边缘效应.
LightCycler / 毛细管 / 试剂的成本核算


仪器的维护费用 LightCycler是免维护的仪器,采用的光源是普通 的发光二极管，寿命长达20000小时以上，非常 稳定，价格低廉。而卤素灯光源，寿命<2000小 时，发光强度衰减明显，需要定期更换，价格 昂贵。 单一反应成本的计算 单一反应成本包括试剂成本和反应管成本，由 于毛细管的反应体系是10~20ul，而其他同类机 器的反应体系是50ul，所以使用LC试剂的成本 可以减少至少一半。
实时荧光定量PCR 仪
一、实时荧光定量PCR的原理
荧光定量 PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对 结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的 PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。
杂交探针检测－罗氏专利性技术
for sequence specific detection of DNA
Fluorescein
LC Red
Denaturation
Annealing
Elongation
End of Elongation
Monitoring of PCR with the LightCycler Using Hybridization Probes
杂交探针的优点： 1.灵敏度高 2.宽动力学范围
3.特异性高
4.可用于突变分析
Template: Plasmid; Target: CycA; Detection Format: Hybridization Probes
专用于SNP基因分型和突变检测的 SimpleProbe
SimpleProbe作为一种独特的杂交探针只含有一条寡 核苷酸探针，能够特异性的与目的基因上含有SNP位 点的靶序列结合。探针与靶序列结合后，释放出能够 被检测到的荧光信号，通过对熔点曲线分析中探针释 放的荧光信号强度的分析，可以得到对目的基因的多 态位点的准确分析结果。
R = Reporter (Fluorescein) Q = Quencher
3‘-p
荧光定量PCR仪的部分应用

医学相关研究

疾病的临床早期诊断


病原体的含量检测
合理用药分子水平的疗效研究 疾病的发病监控研究 肿瘤相关基因肿瘤、耐药基因的检测 －各种处理对细胞mRNA含量变化的影响 －比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异
一、LC1.5和LC2.0
LightCycler荧光定量PCR系统
LC1.5
LC2.0
Lightcycler 1.5 结构分析
以空气加热及 冷却迅速改变 温度 带有极高表面积/ 容量比例的密封 20l毛细管 加热线圈 可容纳32个样品的 卡盘 将荧光仪定位的 分档器发动机 热室 将样品置于 光学仪上的 分档器发动 机 风扇 滤器 免维护的 LED光源
New Probe Format : SimpleProbe Format -高效低成本的新型探针
Denaturation phase: SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenched R Q 5‘ Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to it‘s complementary target R primer 3‘ Q 5‘ 3‘-p 5‘
Light Cycler 反应管价格 反应体系 反应液/试剂成本 总反应成本 0.45 USD 10~20 ul 2.4 USD 2.85 USD
其他机型 0.12 USD 50 ul 4.8 USD 4.92 USD
LC1.5与同质产品的对比
Baidu Nhomakorabea项 目
ROCHE
LightCycler 1.5
LED（发光二极管）冷光 源，免维修，开机可以马 上进行操作，寿命>20000 小时。 空气加热，温控变化准确 （±0.4℃） 热传导速率20℃/秒， （0.05-20℃/秒) 30－40分钟 软件可支持单点定标功能
SYBR-Green I 检测模式
SYBR Green I能选择性地与双链DNA结合，在 外界光源激发下产生强烈荧光。在PCR过程中， SYBR Green I可与新合成地双链DNA结合，产生地 荧光信号强度与双链DNA含量成正比，荧光检测在 每一循环的延期后进行。 SYBR Green I与非特异性 双链DNA（如引物二聚体）结合产生的干扰可通过 融解曲线分析而得到解决。




实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时 地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提 高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控，准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便，无需跑胶
罗氏产品介绍以及与 同类产品之间的对比
杂交探针（HybProbe）检测模式
设计与检测区互补的分别带有不同染料标记的一对 寡核苷酸（既杂交探针），在与扩增的DNA片断杂交 时，两种染料互相接近。其中供体荧光染料受外来光 源激发后，将能量传递给附近的受体染料，既发生荧 光共振能量转移（FRET），从而释放出受体染料分子 的发射波长荧光信号。荧光信号的强度和DNA的产量 成正比。其他非特异性产物由于不会与探针杂交，因 而不产生信号干扰。
LightCycler 结构分析
激发光源 Rodenstock-LED （发光二极管） 冷光源，免维护，开机可以马上进行操作。 光学倍增管 (PMT) 空气加热 两种石英玻璃毛 细管体系 (20ul 和100ul)
检测系统
加热方式
灵敏度高，宽检验范围,背景低，无边缘效应 管间差小，热传导速率20℃/秒，温控变化准 确（0.05-20℃/秒）。
定量PCR技术的产生

1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB内插染 料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR 仪检测样品的荧光强度 PCR循环 = 双链DNA = 染料 = 荧光 后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I 取代EB


荧光定量实时PCR与普通PCR的比较
升降温数率唯一可调——可以根据实验的需要 调整升降温速率的系统0.05~20 ℃ /秒，优化实 验。
配套功能强大的分析软件： （1）绝对定量（具“单点定标”功能） （2）相对定量（可进行效率校正） （3）自动基因分型（SNP） （4） 颜色干扰校正 独特的熔点曲线分析功能，可进一步作PCR后分析： --- 检测非特异扩增并作矫正 --- 鉴别基因型而又无需采用测序凝胶 --- 检测点突变，并可利用双色检测及颜色补偿软 件在同 一反应中分析较复杂的突变
ABI ABI 7300
卤素灯。寿命短， 需预热，寿命2000 小时。 半导体加热制冷 （温控±0.5℃） 热传导速率2.5℃/秒
MJ OPTICON I
LED（发光二极 管）,每一个孔位一 个独立的激发光源 和检测装置 。 半导体加热制冷 （温控±0.5℃） 热传导速率2.5℃/秒
备 注
LightCycler光源无需定期 更换，稳定方便，光路相 同，样本误差最小，节约 成本。 LightCycler变温速度快， 温控精确 。 LightCycler升降温速度快， 并可调节 LightCycler检测时间短， 快速出结果，应用最灵活 LightCycler每次实验节约 反应管和反应试剂4－5份， 且单点拟合确保实验结果 石英玻璃管荧光检测灵敏 度好，导热快,试剂用量省
为什么使用DNase-Free & RNase-Free 的光学玻璃 毛细管?

玻璃反应管可加快热传导速率.
毛细管增加表面积/体积比，确保空气和反应成分之间的 温度迅速平衡，温度均一. 缩短了PCR反应时间，特别是荧光激发的时间，保证了 反应成分的稳定性，尤其是荧光染料的稳定性。


缩小反应体系， 降低检测成本。