电生理学方法学

电刺激的种类
方波、直流电、锯齿波、三角波、正弦波…
一、电刺激的基本原理
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刺激电极
神经电刺激的极性法则
1. 通电时的阴极兴奋作用
当与直流电源相连的电极与神经组织接触时，电流 的移动方向是：
A:电流从正极通过膜外溶液流至负极 B:电流从正极流向膜内，通过胞浆流向负极，再经膜 内流出至膜外负极
正极： 内向电流 负极： 外向电流
3.神经元的不应期
条件－检验刺激方法（两刺激参数相同） 通常，神经纤维越粗，传导速度越快，不应期越短。 外周粗纤维不应期：1ms
中枢Aδ-C纤维不应期：0.6-2.0ms
4.激发
重复电刺激脑部（数秒/日,连续数日），如杏仁核、
尾核、海马等，可出现被称为“激发”的现象：
（1）阈值降低 （2）痉挛
癫痫发作（点燃模型）
分级强度刺激法缺点：
随着刺激强度的增加，阈值较高的纤维兴奋的同时， 可使全部粗纤维兴奋。故该法只能选择性兴奋较粗的有 髓纤维. 随着刺激强度的增加，反应的潜伏期也跟着缩短， 从而常带来混淆。 选择性兴奋粗纤维 局麻药（可优先阻断细纤维）＋分级强度刺激
选择性兴奋细纤维
粗纤维对压迫、缺血、缺氧、冷冻或某些药物敏感， 用上述方法将粗纤维阻断后＋分级强度刺激
二、电刺激的物理特性
电刺激：强度、时间、频率。
1.强度 阈强度：能引起可兴奋组织兴奋的最小刺激强度。 相当此种阈强度的刺激为阈刺激；
能恰使膜去极化达到阈限的电流为阈电流。
2.时间 刺激要求一定的作用时间，即刺激脉冲的波宽。 方波的持续时间容易被测到，短脉冲通常比长 脉冲有效，且损伤较小。 刺激脑多用0.10.5ms.
6.定位微刺激
在脊髓,中枢脑部可用微刺激兴奋局部神经组织.
刺激电极: Ø10 - 15μm金属微电极 玻璃微电极(内含钨丝,尖端裸露) 刺激: 弱电流(100 μA) 单脉冲:可直接兴奋神经元 串脉冲:可直接兴奋神经元,也可经突触兴奋神经元
7.机械刺激和温度刺激
8.细胞外,内刺激
方法: 应用多管微电极
有时重复电刺激出现“负激发”：受刺激脑部兴奋性降低。
5.延迟效应
大部分脑组织对电刺激的反应是立即出现，
电刺激运动皮层：1-2S后即出现反应 部分脑区的刺激效应需经数小时或时日才出现
电刺激猫外测下丘脑：1h内无任何反应， 24h后进食量增加600％。
6.可疲劳性
电刺激后脑结构可出现疲劳,先后顺序为： （1）数秒内迅速疲劳，如运动皮层 （2）数分钟内缓慢疲劳，如尾核与壳核 （3）不疲劳，如刺激外侧下丘脑可引起无限期 瞳孔收缩.
减小刺激伪迹方法：
1）增大刺激电极与记录电极之间距离 2）在刺激与记录电极之间连接地线 3）应用隔离器，且隔离器尽可能靠近被刺激生物体
三、刺激电极
电极材料： 1）良性导体；2）毒性小： 3）价格便宜 电极种类： 1）单极电极：要求尖端面积小，可产生足够密度的电流作用– 使膜发生去极化。 电极为一根金属丝，尖端较细，接电源阴极， 无关电极面积较大,接电源阳极。 缺点：刺激伪迹较大。 2）双极电极：两个并列、间隔<1mm或更小但不短路的白金 丝或不锈钢丝。
阳极： 内向电流在具有电阻与电容性质的膜上造成的电压降 与膜原有的极化状态（内负外正）一致，使膜超极化； 阴极： 外向电流造成膜两侧出现内正外负的电压降，与膜原有
的极化状态方向相反，使膜 去极化，达到阈电位水平
产生 动作电位。
2.断电时的阳极刺激作用
电流接通时兴奋发生在阴极，同时阳极部位加重了极化 状态，电荷过剩。 阳极：电流断开时，过剩的电荷消失，膜的状态由通电时的 超极化回到静息状态，这种局部极化状态的消退相当 于去极化。 阴极：断电时阴极部位的去极化减弱，兴奋性有所降低， 称为阴极后阻抑。 通电时兴奋发生在阴极部位，断电时兴奋发生在阳极部位。 通常情况下：通电刺激效应 > 断电刺激效应
给予电流刺激
多管微电极
记录电反应
平衡或给药
注意事项: 1) 被刺激细胞体积应足够大 2) 电极尖端较粗,易损伤细胞
六.刺激电流的扩散
1.有效兴奋点
1939年:分级强度刺激时,AP潜伏期随刺激强度增加而缩短; 1944年:分离坐骨神经标本(5根纤维)发现 1.2 T刺激 2.0 T刺激 Ǿ为15.0μm纤维出现AP Ǿ为9.5μm纤维出现AP
碰撞实验
R
S1
S2
如果S1与S2不同时到达记录点,可分别记录出顺向反应 与逆向反应. 调节S1与S2间隔,使顺向刺激与逆向刺激引起的反应在 同一记录部位相撞时,反应消失.
用途:研究CNS内两点间的机能联系 特点:1.研究神经元之间联系的同时观察其电生理学特性 2.研究刺激部位与记录部位之间的机能联系 3.简便易行
4. 跟随不能
粗纤维可跟随高达 50Hz 频率的刺激(刺激反应一一对应),
50Hz 刺激可阻滞传导速度较慢的A类纤维(Aδ),
10-20Hz时 C纤维被阻滞. 高频刺激可选择性地兴奋粗纤维.
5. 阳极阻滞
阳极下可兴奋组织的静息电位远离阈电位,不易引起动作 电位,使神经冲动传导受阻. 阳极下的粗纤维更容易超极化，首先受到阻滞.
在大鼠在体制备上发现,刺激强度增加时,不仅出现 潜伏期缩短,还可出现2-7个附加的锋电位.
在 CNS 中发现,给予重复电刺激(1-20Hz), 还可出现潜伏期逐渐延长的现象,称“潜 伏期漂移”(latency drifting).
原因:
可能与兴奋后抑制的逐渐积累有关.
3.有效电流扩散
•应用单极刺激电极: 有效刺激距离与阈电流强度之间关系 为 CNS内有髓纤维与刺激电极距离越远,阈值越高; 统一距离情况下,纤维传导速度越快,阈值越低. •刺激电流有效扩散半径与电极种类和电极尖端大小有关 单极电极:有效扩散半径最大 双极电极:有效扩散半径次之 同心圆电极:有效扩散半径最小 •Ф10μm的单极刺激电极: 10 μA短脉冲,扩散范围为150 μm内有髓纤维 100 μA短脉冲,扩散范围为500μm内有髓纤维
刺激电极与记录电极之间距离缩短
潜伏期变短
2.潜伏期跳跃
1979 记录下丘脑腹内侧核对刺激中脑中央灰质 引起的逆向反应中发现.随着刺激强度增大, 逆向反应的潜伏期可缩短或向前跳跃,最大 可达9.8ms.
将此种发生在神经元上AP潜伏期缩短的现象 称为“潜伏期跳跃”.
原因:
1)电流扩散使刺激电极与记录电极间距离缩短; 2)刺激部位神经元轴突侧支有不同的阈值. 电流扩散并兴奋其他传入纤维,引起附加 AP.
R S
问题：应用双极刺激电极时, 电极的极性应如何放置？
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急性实验用电极
导电性能是首要标准. 仍需注意插入神经组织的电极可引起神经元坏死、 毛细血管破裂、组织水肿等不良反应。
慢性埋藏电极
在神经组织中埋藏刺激或记录电极，便于在动物正 常清醒情况下，给予刺激或记录神经元电反应。
金属材料对神经组织的毒性是首要标准。长期埋置 电极可造成：局部胶质细胞增生、神经元核仁位置 改变等结构变化。 白金 不锈钢 钨 银 铜
例： 外周神经干 AP 中 Aα 纤维成分出现为 1T Aβ 纤维成分出现为 2T Aδ 纤维成分出现为 5T C 纤维成分出现为 20T
刺激伪迹
刺激电流（电压）通常比生物电反应大，刺激脉冲可被 记录电极拾取，记录系统形成伪迹。 电阻成分 伪迹的成分： 电容成分 刺激伪迹与刺激强度成正比，过小：不能起标记作用 过大：覆盖生物信号
3.频率
绝对强度尺度：较精确的方法是测量电极-组织电阻。 电刺激类型、输出阻抗、强度、时间、频率 电极与组织的相对位置、电极的几何形状与 物理特性、神经组织的成分… 相对强度尺度(生物校准，biocalibration) ： 用刺激引起的生物效应作为刺激强度的相对尺 度。以刚出现的电反应为1T，更强的刺激以 1T的倍数表示。 优点：以生物效应将刺激强度标准化，且易于监测。
四、神经组织制备的特性
1.可兴奋组织的电导与其含水量有关。 肌肉组织含水量：75％ 脑组织含水量：68％ 电导的不均匀性提示：强电流刺激可使电流流向 非预期刺激的结构。故中枢宜采用微刺激。 2.神经纤维的直径 细胞外刺激条件下 • 直径粗的轴突：施加弱电流即可兴奋 直径细的轴突：施加强电流才可兴奋
1.分级强度刺激
弱刺激：兴奋Ⅰ类纤维，以Aα出现为1T
刺激强度 ( T ) 1.3 - 2.0 2.0 - 2.5 5.0 5.0以上 兴奋的纤维 Ⅱ类（ Aβ） Ⅰ类（ Aα）达最大值 Ⅱ类（Aβ） 达最大值 Ⅲ类开始兴奋
弱刺激：兴奋Ⅰ类纤维，以Aβ出现为1T
3.0 – 6.0 10.0 15.0-20.0 Aδ 所有的有髓纤维 C
2.双排放刺激（条件－检验刺激）
原理：利用轴突的不应期,刺激特定的细纤维。
方法 1.条件刺激强度：达到使全部粗纤维都兴奋的程度； 2.检验刺激强度：除兴奋全部粗纤维外，还应兴奋 一种以上细纤维 (Aδ,C)； 3.调节2个脉冲间隔并逐渐缩短,使检验刺激出现在 条件刺激引起的全部粗纤维兴奋的不应期内,此时 原来由检验刺激兴奋的粗纤维均不出现反应,只剩 下原有检验刺激兴奋的细纤维成分 选择性兴 奋细纤维.
方法
在可控制直流电作用下,随着电流强度的增加,受阻 滞的神经纤维按照以下顺序先后受阻: 50 - 500μA Aα Aβ Aδ ……
不足:1)神经纤维有快速损伤的危险(直流电热效应与
电解效应) 2)断电时出现阳极兴奋
改进:1)选用阴极,阳极位置倒换的短脉冲电流 2)选用前沿陡,后沿呈指数下降的三角波 3)选用三级电极(两端为阳极,中间为阴极)
五.选择性刺激
在中枢做选择性刺激绝非易事。
选择性刺激外周神经某类纤维的常用方法， 是在刺激同时结合应用选择性阻断另一类纤维。
如 • 结合使用优先阻断细纤维的局麻药阻滞下，选择性 兴奋粗纤维； • 结合压迫、窒息、缺血、冷却，应用苦毒毛旋花子 甙(ouabain)等方法，优先刺激细纤维。 就电刺激本身而言，主要应用分级刺激、双重排放 刺激和高频刺激等方法。
电生理学方法学
Methodology of Electrical Physiology
电刺激方法学
Methodology of Electrical Stimulation 起源：1791年，电流计的发明 发展：
20世纪20年代
20世纪50年代 20世纪60年代 20世纪70年代
电子管放大器、阴极射线 示波器 微电极技术 电压钳技术 膜片钳技术
3.0 T刺激
10.0 T刺激
Ǿ为8.0μm纤维出现AP
Ǿ为4.0μm纤维出现AP
？ 期随着细纤维AP的出现而向前移动,即随着刺激强度增
问题:上述逐次被兴奋的纤维,特别是粗纤维AP的潜伏 大,粗纤维AP潜伏期缩短.
原因:
刺激强度增大
电流向更远距离扩散
刺激的有效兴奋点由原来的
阴极下逐渐向记录电极处移动
神经科学的发展与电生理学技术的进步密切相关
与神经科学有关的诺贝尔奖项
电生理
电生理学实验室布置示意图
主要内容：
1.电刺激的基本原理与特性
2.神经组织制备的特性 3.选择性电刺激方法 4.刺激电流扩散的控制
电刺激是适宜的人工刺激
1. 性质易于描述 2. 施行方便，可精确控制。 3. 刺激是可逆的，短时间内可重复给予。
迷走神经刺激术(Vagus Nerve Stimulation,VNS)
80年代末90年代初： 美国开发出迷走神经刺激系统（Neurocybemetic Prosthesis System, NCP），将 VNS术首次应用于临 床，用于控制患者的癫痫发作。
NCP系统：
• 脉冲发生器
设置输出脉冲的强度，频率，波 宽，信号输出时间，间断时间等。 富有弹性，对神经的损伤小， 连接导线具有抗腐蚀性，且具 有弹性和韧性；并装有缓冲和 固定装置，以最大限度地减少 电极对神经的牵拉。
4.刺激电流与扩散距离关系
•刺激电极位于神经组织深部,其尖端完全被神经组织 包裹,刺激电流以辐射形式向所有方向以球形扩散; •刺激电极位于神经组织表面,刺激电流以半球状对称 流动 •最容易兴奋的部位是有髓纤维朗飞氏结,0.1μA即可 将其兴奋,故刺激电流扩散取决于电极与朗飞氏结的 距离
电刺激在临床上的应用
3.顺向刺激与逆向刺激 （Anti-stimulation and ortho-stimulation）
顺向刺激与记录
R
S顺 逆向刺激与记录 逆向反应的特点: 1.相对恒定的潜伏期; 2.可跟随高频电刺激; 3.碰撞实验是检验逆向 反应的标准.
R
S逆
问题:如传导距离相等,顺向反应与逆向反应的潜伏期 ？ 是否有差别?