小鼠表皮细胞的原代培养 细胞生物学

综合设计性实验报告

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实验六细胞培养

——小鼠表皮细胞的原代培养

摘要目的探讨体外分离和培养小鼠表皮细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合

酶消化法和组织块法对新生小鼠表皮细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠表皮细胞组织剪成小于1mm³大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将组织块接种于培养瓶中进行体外培养。）结果新生小鼠表皮细胞克隆2~3d后开始形成［1］，细胞呈梭形，体外培养一个星期后仍能够保持良好的生长状态。结论采用该方法能够实现对小鼠表皮细胞的体外原代培养，并且细胞贴壁生长的速度比单纯采用酶消化法和组织块法大大提高。

关键词原代培养小鼠表皮细胞酶消化法组织块法

1前言

目的：初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。意义：细胞培养技术目前已经广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学等领域，已发展成为一种重要的生物技术。为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。［2］方法：结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。结果：运用这种方法成功并比较快速地培养出原代表皮细胞。结论：这种方法为广泛开展表皮细胞原代培养奠定了基础。

2实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用组织块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

3实验用品

3.1器材

每小组：

解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管（如有条件，吸管最好由可消毒移液器及其Tip取代）：直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶（或细胞培养皿）：小组人数+1个；青霉素瓶及瓶塞：小组人数+2个（其中一个用于分装胰酶液）；血细胞计数板1块, 盖玻片; 2～5ml注射器及注射针头1套；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。分类彻底清洗、干燥、包装、消毒灭菌后备用（用于取材接种及培养）。

每大组共用：

用于分装培养用液：盐水瓶250 ml1个、100 ml2个（或100、50各1个），配套100 （或50ml）盐水瓶塞2个，1 ml刻度吸管2支，吸管胶头（小）2个，青霉素瓶及瓶塞1个/小组。

用于无菌操作：不锈钢杯子1个（作废液缸）；解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，酒精灯1台、打火机1个。

用于装载及包装物品：有盖白瓷盘2个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装

盖玻片)1个。

用于超净工作台内放置需多次使用的吸管：试管12支；试管架1个。

记号笔1支等。

3.2试剂

3.2.1清洗用液：5%稀盐酸、1%稀盐酸、2%NaOH、洗洁精、单蒸水、三蒸水、清洗液（用浓硫酸和重铬酸钾配制、全班共用）等。

3.2.2消毒剂（用前配制）：甲醛、高锰酸钾、新洁尔灭、75%酒精、碘酒、过氧乙酸等。

3.2.3 培养用液：

3.2.3.1 细胞培养用液（每大组100mL，用100mL盐水瓶装）：经过滤过的F10 （RPMI1640）培养基占80~90%、经过滤除菌的小牛血清占10~20%,加入经过滤除菌、终浓度各为100国际单位的抗菌素。

3.2.3.2细胞消化液（每小组1青霉素瓶，约5mL）：经过滤除菌的0.25%胰蛋白酶

或EDTA—胰蛋白酶液。

3.2.3.3平衡盐溶液：不含钙、镁离子的Hank液：每组约50mL，用50（或100）mL 盐水瓶装。

3.3 材料：新生小白鼠

4实验方法

4.1技术路线清洗玻璃仪器,胶塞→制备消毒棉球→包装分装培养液用液用品→

消毒分装培养用液用品→分装培养用液→包装原代培养接种用品→实验时的准备工作如小组所示→打开腹腔，切取小鼠皮肤组织块→洗去血污→剔除多余成份→剪成小于1mm³大小的组织块→胰蛋白酶消化组织块→接种组织块→贴壁→培养→观察和记录

4.2 实验步骤

1 玻璃仪器的初步清洗、开始培育小白鼠（第一批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等）

2 继续培养乳鼠（第二批雌鼠与雄鼠混养、观察记录阴道口的情况等），玻璃仪器的清洗（清洗液浸泡）、胶制品的清洗。

3 继续培养乳鼠（常规饲养工作）、完成清洗工作（包括各类物品）、制备消毒用棉球、包装分装培养用液用品。

4 继续培养乳鼠（常规饲养工作、留意小鼠的出生）、消毒分装培养用液用品、分装

培养用液、包装原代培养接种用品。

5 消毒原代培养接种用品

6 细胞原代培养［3］

(1)洗手操作者用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌室

(2)准备工作：

［1］操作者于超净台内用酒精棉球消毒双手，待酒精稍干后点燃酒精灯，然后用酒精棉球消毒工作面。

［2］去掉Hank液、细胞培养液、酶液的包装纸。

［3］打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架

［4］取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，试管一支，插入相应的试管中。

［5］打开培养皿以及解剖工具手持端的包装

(7)处死小鼠(脱臼法) →消毒（放入含75%酒精的烧杯中浸泡数秒）。将以处死消毒的

小鼠转移至超净工作台内的培养皿盖内，背部朝上。培养皿倒扣于包装纸上待用。

(8)解剖取皮肤：用酒精棉球擦拭背部，在腰部后缘用解剖镊提起皮肤，用解剖剪呈T

形剪开皮肤，再用眼科剪切取皮肤组织块，置于无菌培养皿中。

(9)用Hank液洗涤皮肤组织2次，吸去Hank。

(10)剪碎组织块：换另一套眼科剪将组织块剪成小于1mm³的组织块（大小尽量一致）。

用Hank液洗涤，弃Hank液。

(11)酶消化：将胰蛋白酶液加入装有组织块的青霉素瓶中，盖紧盖子，置超净工作台

内中消化5—10min，知道组织块变松软、粘稠状，颜色略变白色为止。

(12)将培养液直接加入盛有胰蛋白酶和皮肤组织块的青霉素瓶中，利用其中的牛血清

终止酶消化的作用，弃去酶液和培养液的混合液。加入培养液重复此操作2—3次。

(13)取一培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、姓名、材料名称

等信息）

(14) 用培养液湿润的吸管小心吸取组织块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照一

定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好

(15) 翻转培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液。

(16) 将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置（加入的培养液不浸泡植块，不从

瓶口流出）

(17) 4小时后，待组织块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮；(18)

观察至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

［1］培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。

［2］细胞生长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。

可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。

［3］培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好。

经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。

a 无菌室的准备工作如小组方案中所示

b 从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液

c 用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液

d 加入与换液前相同的量的培养液

e 放回原来的培养箱继续培养