大鼠钙化血管平滑肌细胞IP3RⅠ表达的变化
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制 目前 尚不完全 清楚。Ｉ３ 为细胞 内钙激动剂 ， 内 Ｐ作 与 质 Biblioteka Baidu上的 Ｉ３ （ 际上是 ｃ “通道 ） 合 ， ＰＲ 实 ａ 结 其结果使钙 通道活化 、 开放 ， 大量 ｃ “从 钙库 内迅速 释放 ， ａ 也可使 储存在胞核被膜 间隙 的钙释放人 核浆 和胞浆 中 ， 使 胞质 内的 ｃ “浓度迅速升 高 ， ａ 这对产 生复杂 的时空
长依序测量各孑 的吸光度 （ Ｄ值 ） Ｌ Ｏ 。
１７ 比 色法测定大鼠主 动脉 Ｖ ＭＣ Ｌ ． Ｓ ｓ Ｐ活性 根据 Ａ
１３ 大鼠主动脉 Ｖ ＭＣ 的茜素红染 色 １ ． Ｓ ｓ ２孔板 中置
入玻 片 ， 细胞 均匀 接 种 于 １ 将 ２孔板 中， 常培 养 ６ｄ 正 后， 细胞均 匀贴壁 ， 对照组和钙化组给予不 同的培养基 培养 ， ３天 换 液 １次 ， 养 ６ ｄ 每 培 。移液 器 吸去 上清 ， Ｐ Ｓ冲洗 ２遍 ， Ｂ 加入 ４ 的 甲醛 溶 液 于 ４ 冰 箱 中过 ％ ℃ 夜， 后用 Ｐ Ｓ冲洗 ２遍 ， Ｂ 加入茜素 红（ ０ｍ ｏ、Ｈ ８ ８ ５ ｍ ｌｐ ． ）
反应 ３ ｉ；℃ ， ００ｒｒｎ离心 １ ｉ， ０ｍｎ ４ ８ ０ ａ ／ｉ ０ｍｎ 取上清 （ 即 蛋 白提取 液） 加入 Ｐ Ｆ调至终浓度为 １ ， ２ ℃ 保 ＭＳ ％ 一０ 存 。取少量蛋 白提取液 ， 以牛血清 白蛋 白为标准物 ， 采
化， 以进一步 阐明血管钙化 的机制 。
２１ ０ ０年 ９月 ， 我们采 用磷 酸二 氢钠 （ ａ Ｏ ） 导大 ＮＨ Ｐ 诱 鼠动脉 Ｖ Ｍ ｓ 化 ， 用 Ｗｅ ｅ ｌ 法及 实 时荧光 ＳＣ 钙 应 ｓｒ ｂ ｔ ｔｎ ｏ
定量反转录 Ｐ Ｒ法测 定细胞 钙化 时 Ｉ３ Ｃ Ｐ Ｒ Ｉ的表达变
析 将离 心管中的细胞 加入 ＲＰ ＩＡ裂 解液匀浆 。冰浴
表 １ 各组 ｃ 含量及 Ａ Ｐ活性 ａ Ｌ ±ｓ
出现“ 钙诱 发的钙 释放 ” 现象 …。这是 Ｒ Ｒ型钙释 ｙ 放的特点 ， 即随着 钙库 钙 的释 放 ， 开放 细胞 膜 上操 纵
ｃ “的通道 ， ａ 引起 充 电式 ｃ “ 内流 ， 进细 胞外 ｃ ａ 促 ａ 向细胞内转 移 ’ 。因此 ， ３作 为细 胞 内与钙 信号 “ Ｉ Ｐ 相关的第 二 信使 ， Ｉ３ 与 Ｐ Ｒ结 合 可 以调 控 细胞 内钙 释 放 。细胞 钙化时存在 细胞 内钙超载 ， 但是细 胞钙 化时 细胞 内 Ｉ３ Ｐ Ｒ有何变化未 见报道 。
试剂 盒说 明 ， 细胞培养 液 ， 弃去 细胞 用 Ｐ Ｓ洗 ３遍 ， Ｂ 加 入 ５ ０Ｉ ０ Ｌ裂解 液 ， ｘ 移至预 冷的 ｅｐｎ ｏ 管 ， ｐ ｅｄｒ ｆ 强力 振荡 １ ， ￣ 孵育 ３ ｉ； ５Ｓ３ Ｃ ７ ０ｒ ｎ 在分光光度计（ ａ 波长 ４ ５ｎ 测 ０ ｍ） 定 吸光值 ， Ｌ 性用 Ｐ一硝基 苯酚 为标 准值 计算 ， Ａ Ｐ活 １ 单位表示 ３ ｉ ０ｒｎ内产生 １ｎ ｏ Ｌ硝基苯酚的活性。 ａ ｍ ｌ ／ １ ８ 统计 学方法 ． 应用 Ｓ Ｓ ３ ０统计软件 ， 对 Ｐ Ｓ１． 首先
Ａ： 照 组 （ 头所 指 为 正 常 细 胞 ）； 钙 化 组 （ 头 所 指 为 钙 化 细 对 箭 Ｂ： 箭
胞内钙化点）
图 １ 大 鼠 Ｖ ＭＣ 茜素红染 色（× ０ ） Ｓ ｓ ４ ０
性 ｃ “信号 是非常关键 的 。胞 内钙库上存在 ２种钙 ａ 通道 ： ３ Ｉ Ｒ和 Ｒ Ｒ， Ｐ ｙ 它们 的结 构和 功 能 比较 相 似 。而
计量资料进行方差齐性检验 ， 判定数据是 否正态分布 ， 正态分布的数据两两 比较 应用 Ｌ Ｄ— 检验 。 Ｓ ｔ
２ 结 果
哺乳动物细胞包含 ２个 ｃ “胞 内钙释放 通道 ， ａ 即
三磷酸 肌醇 受体 （Ｐ Ｒ） 雷 尼丁受 体 （ ｙ 。其 中 Ｉ３ 和 Ｒ Ｒ）
Ｉ３ Ｐ Ｒ至少 包含 Ｉ、 Ⅲ型 。研 究证 实其 ３种 亚型 与 Ⅱ、 Ｉ３的亲和力 ： ３ Ｐ Ｉ ＲＩ Ｐ Ｒ Ｉ＞Ｉ３ Ｕ ， Ｖ Ｍ ｓ Ｐ Ｉ＞Ｉ３ Ｐ ＲＩ Ｊ在 Ｓ Ｃ
１２ 实验 细胞 ． 大鼠胸大 动脉 Ｖ ＭＣ （ ７５ 购 于中 Ｓ ｓ Ａ ｒ） 国科 学院上海 细胞库 。经 传代 培养 后随机 分 为两组 ： 对 照组和钙化组 ； 实验第 １ ６天将细胞 培养至长满瓶 ～ 底 ， 细胞 密度为 １ ・ ｍ～， 测 ０ ｍ 对照组 给予正 常对照 的 Ｇ Ｍ培养基 ３ｍ ， ＭＤ Ｌ 钙化组给予 Ｎ Ｈ Ｐ ａ Ｏ 配制浓度 为
１ 材料与方法 １ １ 实验 材料 ． Ｎ Ｈ Ｐ 自天 津 市永文 化学 试剂 ａ Ｏ 购
用 改 良酚试 剂 法 ， 测 其 中总 蛋 白含量 。并 转 移 至 检 ＰＤ Ｖ Ｆ膜上 ， 应用 ５ ％脱 脂奶粉 封闭 ， 随后 置于 Ｉ３ Ｐ ＲＩ
抗 中。室温洗膜 ， ３次 。之后置人二抗溶液 中 ， 共 抗 体结 合 区带 用 化 学 发 光法 检 测 定 量值 （Ｏ ＩＤ值 ） 将 ，
李芳， 李绍冰 ， 姚丽霞， 苑晓烨
河北省人 民医院老年病二科（ 石家庄 ００ ５ ） ５０ １
【 摘要】 目的 检测大鼠血管平滑肌细胞（ Ｓ Ｃ ） Ｖ Ｍ ｓ钙化过程中１４５三磷酸肌醇受体 Ｉ Ｉ Ｒ Ｉ） ，， 型（Ｐ 表达 ３
水平 的变化 。方 法 采用磷 酸二氢钠（ ａ Ｏ ） Ｎ Ｈ Ｐ 诱导大 鼠动脉 Ｖ ＭＣ 钙 化 ， 用 Ｗｅｔ ｎｂｏ 法及 实时荧光定量 Ｓ ｓ 应 ｓ ｒ ｌ ｅ ｔ 在 Ｖ ＭＣ Ｓ ｓ钙化 时 Ｉ３ Ｐ Ｒ Ｉ表 达 水平 明显 增 高 （ Ｐ＜ 反转 录 Ｐ Ｒ法测定 细胞钙 化 时 Ｉ３ Ｃ Ｐ Ｒ Ｉ表达 的 变化。结 果
达和骨样结构形 成 。Ｖ ＭＣ 表型转 化是 高血 压 、 脉 Ｓ ｓ 动 粥样硬 化 和 心 肌 梗 死 等 心 血 管 疾 病 的 共 同发 病 基
础 。三磷酸肌醇 （Ｐ ） 近年来逐 渐被 关注 的一种 Ｉ３ 是 细胞信号传 导 分子 ， 在许 多 的病 理状 态下 会 发生 Ｉ３ Ｐ
胞外配体与胞浆 膜 Ｇ蛋 白受体 或 酪氨 酸激 酶受 体结 合， 激活磷脂酶 Ｃ产生 Ｉ３ 后者主要刺激分 布在肌浆 Ｐ，
网、 内质 网的 Ｉ３ 使 钙通 道开放 ， 生瞬 间振荡和钙 Ｐ Ｒ， 产 波等复杂的胞浆钙浓度信 号 ， 作为 细胞 内 ｃ 释放通 ａ
道， ３ Ｉ Ｒ精确地调控胞 浆 内 ｃ “浓 度 的变化 ， 而发 Ｐ ａ 从 挥多种生物学效 应 。而 Ｉ３ Ｐ Ｒ参 与 细胞钙化 的发 病机
染 色 ，７ ３℃温箱 中孵 育 ３ ｉ， ０ｍｎ 弃茜 素 红染 料 ，Ｂ Ｐ Ｓ冲
．
２３ ． ９８
广东晖学 ２１ 年１ 月第３ 卷第２ 期 Ｇ ａｇｏｇ ｅｉｌｏｒ ｌ ｏ ２１， ｏ ３ ， ｏ ２ ０１ １ ２ ２ ｕｎｄｎ Ｍ ｄ ａＪｕ ａ ｃ ｎ Ｎｖ ０１ Ｖ１ ２ Ｎ． ２ ． ．
广东医学 ２ １ 年 １ 月 第 ３ 卷第 ２ 期 Ｇ ａ ｇ ｏ ｇＭｅ ｉ ｌ ｏ ｒ ａ ｏ ． ０ １ ｖ Ｉ ３ ， ｏ ２ ０１ ｉ ２ ２ ｕ ｎｄｎ ｄ ａ Ｊｕｎｌ ｖ ２１ ， ０ ２ Ｎ ． ２ ｃ Ｎ ．
・
２３ ・ ９７
大 鼠钙 化 血 管 平 滑 肌 细 胞 Ｉ３ 表 达 的变 化 Ｐ ＲＩ
２ １ 大鼠 Ｖ ＭＣ ． Ｓ ｓ的形 态学改变 对照组 大 鼠 Ｖ Ｍ ｓ Ｓ Ｃ 呈梭形 ， 排列整齐 ， 未见钙 化点 ； 钙化 组 Ｖ Ｍ ｓ Ｓ Ｃ 呈梭形 或多 角 形 ， 列 紊 乱 ， 浆 内可 见 褐 色 钙 化 点。见 排 胞
图 １
表达大量 Ｉ３ 而 Ｉ３ 、 １ Ｐ Ｒ Ｉ， Ｐ ＲＩ １型则 表达很 局 限。细 Ｉ１
０Ｏ ） ． １ 。结论
Ｖ ＭＣ Ｓ ｓ的 Ｉ３ 表达增 强可能参 与 了细胞 钙化的发生。 Ｐ ＲＩ
【 关键词 】 磷 酸二 氢钠 ； 细胞钙化 ；１４ ５三磷酸肌醇受体 ； 管平滑肌 ，， 血
血管钙化是老年人常见 的一种异位钙 化的病理现
象， 它与心肌梗死 、 脑卒 中和猝死等心脑 血管疾患密切 相关 。血管钙化既 往被认 为是 一个 被动 过程 … ， 是老 年化导致 的血管退行性变化 。近年 的研究 显示血管 的 钙沉积 是类似 于骨形 成 的主动可调 节过程 ， 括血管 包
的改变 。但 细 胞钙 化 时 １ ４ ５三 磷酸 肌醇 受 体 Ｉ型 ，，
（Ｐ Ｒ Ｉ） 达 有 何 变 化并 不 清 楚。２ ０ Ｉ３ 表 ０９年 １ 至 ０月
比， 到 目的基 因表达 的相 对定量值 （ Ｑ值 ） 将 Ｒ 得 Ｒ ， Ｑ 值 用于统计分析 。
１ ５ 大 鼠 主 动 脉 Ｖ ＭＣ ． Ｓ ｓ蛋 白提 取 与 Ｗｅｔｒ ｌｔ分 ｓ ｎ ｂｏ ｅ
平滑肌细胞 （ａｃｌ ｏｔ ｕｃ ｅ ｓＶ ＭＣ ） ｖｓ ａ ｓ ｏ ｍ ｓｌ ｃｌ ， Ｓ ｓ 等钙 ｕ ｒｍ ｈ ｅ ｌ 化血 管细胞 向成骨细 胞表型 转换 、 骨相关基 质 的表 成
洗 ２遍 ， 将玻片取 出， 置于载玻 片上 ， 置在 １ ４ 放 ０× ０倍 显微镜下 照相。 １４ 实时 荧光 定量反 转 录 Ｐ Ｒ 法 Ｉ３ 物 序 ． Ｃ Ｐ Ｒ Ｉ引 列： 上游 引物 ５ 一Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ａ一 下 游 ３， 引物 ５ 一Ｔ Ｇ ｃ ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ａ ３ 。将 标 本 加 Ｉ ＧＡ Ａ ＧＡ Ｇ ｃＡ Ｇ 入 反转 录反应液 中 ，２ 反转录 ５ ｉ，５Ｃ ５ｍ ｎ灭 ４％ ０ｍｎ ９ ｏ ｉ 活反转 录 酶。在将 反 转 录产 品加 入 Ｐ Ｒ反 应 液 中 ， Ｃ Ｐ Ｒ热循环参数 ：６ ４ ｍ ｎ 然后 三 步反 应 ：４ ３ Ｃ ９ ℃ ｉ， ９℃ ０ Ｓ５ ℃ ３ ，２ ３ ， ，８ ０Ｓ７ ％ ０Ｓ进行 ４ ０个循环 ， 于每个循环 的 第 ３步 即 ７ ％ ３ 收集荧光信号 。扩增完毕后 ， 入 ２ ０Ｓ 进 结果 分析界面 ， Ｇ Ｐ Ｈ为 内参照 基 因， 以 ＡＤ 与对 照组 相
胞质 内 ｃ “浓度升高引起 Ｒ Ｒ敏感 的钙库释放钙 ， ａ ｙ
２ ２ 大 鼠 Ｖ Ｍ ｓ的 Ｃ 含 量及 Ａ Ｐ活性 钙化 组 ． ＳＣ ａ Ｌ
ｃ “含量较对 照组 显著 增加 （ ａ Ｐ＜０ ０ ） 相对 于对 照 ．１ ， 组， 钙化组 的 Ａ Ｐ活性 显著增 高（ ００ ） Ｌ Ｐ＜ ． １ 。见表 １ 。
一
开发 中心 ； 碱性磷 酸酶 （ Ｌ ） Ａ Ｐ 检测 试剂 盒购 于南 京建 成 生物公 司 ； ａ Ｃ 定量 检测 试剂盒 购 于上海 沪峰 科技
有 限公司 ； ３ 检 测试 剂盒 （Ｃ一 ８ １ ） Ｉ ＲＩ Ｐ Ｓ ２ ６ ４ 购于 Ｓｎａ ａｔ
Ｃｕ 公 司， ｒｚ 随机 引 物 （ａｄｍ ｐ ｍ ｒ） ｒｎ ｏ ｒ ｅｓ 为美 国 Ｐｏ ｅａ ｉ ｒ ｇ ｍ 公 司产品。
２ｍ ｏ Ｌ的 Ｇ Ｍ培养基 ３ｍ 。 ｍｌ ／ ＭＤ Ｌ
Ｉ Ｄ值用 于统计分析 。 Ｏ １６ Ｅ ＩＡ测定大鼠主 动脉 Ｖ Ｍｃ ａ ． ＬＳ Ｓ ｓｃ “定量 分别 设 空 白孔 （ 白对 照孔不加样 品及酶标试剂 ， 空 其余各 步 操作相 同） 标准孔 、 、 对照孔 、 待测样品孔。在 酶标包 被 板 上标准 品准确加 样 ５ ， 测样 品孔 中先 加样 品 ０ 待 稀 释液 ４ ， Ｏ 然后再加 待测样 品 １ （ 品最终 稀 Ｏ 样 释度 为 ５倍 ） 。加样将样品加于酶标板孔底部 ， 尽量 不 触 及孑 壁 ， 轻晃 动混 匀。以空 白孔调 零 ，５ ｍ 波 Ｌ 轻 ４０ｎ
长依序测量各孑 的吸光度 （ Ｄ值 ） Ｌ Ｏ 。
１７ 比 色法测定大鼠主 动脉 Ｖ ＭＣ Ｌ ． Ｓ ｓ Ｐ活性 根据 Ａ
１３ 大鼠主动脉 Ｖ ＭＣ 的茜素红染 色 １ ． Ｓ ｓ ２孔板 中置
入玻 片 ， 细胞 均匀 接 种 于 １ 将 ２孔板 中， 常培 养 ６ｄ 正 后， 细胞均 匀贴壁 ， 对照组和钙化组给予不 同的培养基 培养 ， ３天 换 液 １次 ， 养 ６ ｄ 每 培 。移液 器 吸去 上清 ， Ｐ Ｓ冲洗 ２遍 ， Ｂ 加入 ４ 的 甲醛 溶 液 于 ４ 冰 箱 中过 ％ ℃ 夜， 后用 Ｐ Ｓ冲洗 ２遍 ， Ｂ 加入茜素 红（ ０ｍ ｏ、Ｈ ８ ８ ５ ｍ ｌｐ ． ）
反应 ３ ｉ；℃ ， ００ｒｒｎ离心 １ ｉ， ０ｍｎ ４ ８ ０ ａ ／ｉ ０ｍｎ 取上清 （ 即 蛋 白提取 液） 加入 Ｐ Ｆ调至终浓度为 １ ， ２ ℃ 保 ＭＳ ％ 一０ 存 。取少量蛋 白提取液 ， 以牛血清 白蛋 白为标准物 ， 采
化， 以进一步 阐明血管钙化 的机制 。
２１ ０ ０年 ９月 ， 我们采 用磷 酸二 氢钠 （ ａ Ｏ ） 导大 ＮＨ Ｐ 诱 鼠动脉 Ｖ Ｍ ｓ 化 ， 用 Ｗｅ ｅ ｌ 法及 实 时荧光 ＳＣ 钙 应 ｓｒ ｂ ｔ ｔｎ ｏ
定量反转录 Ｐ Ｒ法测 定细胞 钙化 时 Ｉ３ Ｃ Ｐ Ｒ Ｉ的表达变
析 将离 心管中的细胞 加入 ＲＰ ＩＡ裂 解液匀浆 。冰浴
表 １ 各组 ｃ 含量及 Ａ Ｐ活性 ａ Ｌ ±ｓ
出现“ 钙诱 发的钙 释放 ” 现象 …。这是 Ｒ Ｒ型钙释 ｙ 放的特点 ， 即随着 钙库 钙 的释 放 ， 开放 细胞 膜 上操 纵
ｃ “的通道 ， ａ 引起 充 电式 ｃ “ 内流 ， 进细 胞外 ｃ ａ 促 ａ 向细胞内转 移 ’ 。因此 ， ３作 为细 胞 内与钙 信号 “ Ｉ Ｐ 相关的第 二 信使 ， Ｉ３ 与 Ｐ Ｒ结 合 可 以调 控 细胞 内钙 释 放 。细胞 钙化时存在 细胞 内钙超载 ， 但是细 胞钙 化时 细胞 内 Ｉ３ Ｐ Ｒ有何变化未 见报道 。
试剂 盒说 明 ， 细胞培养 液 ， 弃去 细胞 用 Ｐ Ｓ洗 ３遍 ， Ｂ 加 入 ５ ０Ｉ ０ Ｌ裂解 液 ， ｘ 移至预 冷的 ｅｐｎ ｏ 管 ， ｐ ｅｄｒ ｆ 强力 振荡 １ ， ￣ 孵育 ３ ｉ； ５Ｓ３ Ｃ ７ ０ｒ ｎ 在分光光度计（ ａ 波长 ４ ５ｎ 测 ０ ｍ） 定 吸光值 ， Ｌ 性用 Ｐ一硝基 苯酚 为标 准值 计算 ， Ａ Ｐ活 １ 单位表示 ３ ｉ ０ｒｎ内产生 １ｎ ｏ Ｌ硝基苯酚的活性。 ａ ｍ ｌ ／ １ ８ 统计 学方法 ． 应用 Ｓ Ｓ ３ ０统计软件 ， 对 Ｐ Ｓ１． 首先
Ａ： 照 组 （ 头所 指 为 正 常 细 胞 ）； 钙 化 组 （ 头 所 指 为 钙 化 细 对 箭 Ｂ： 箭
胞内钙化点）
图 １ 大 鼠 Ｖ ＭＣ 茜素红染 色（× ０ ） Ｓ ｓ ４ ０
性 ｃ “信号 是非常关键 的 。胞 内钙库上存在 ２种钙 ａ 通道 ： ３ Ｉ Ｒ和 Ｒ Ｒ， Ｐ ｙ 它们 的结 构和 功 能 比较 相 似 。而
计量资料进行方差齐性检验 ， 判定数据是 否正态分布 ， 正态分布的数据两两 比较 应用 Ｌ Ｄ— 检验 。 Ｓ ｔ
２ 结 果
哺乳动物细胞包含 ２个 ｃ “胞 内钙释放 通道 ， ａ 即
三磷酸 肌醇 受体 （Ｐ Ｒ） 雷 尼丁受 体 （ ｙ 。其 中 Ｉ３ 和 Ｒ Ｒ）
Ｉ３ Ｐ Ｒ至少 包含 Ｉ、 Ⅲ型 。研 究证 实其 ３种 亚型 与 Ⅱ、 Ｉ３的亲和力 ： ３ Ｐ Ｉ ＲＩ Ｐ Ｒ Ｉ＞Ｉ３ Ｕ ， Ｖ Ｍ ｓ Ｐ Ｉ＞Ｉ３ Ｐ ＲＩ Ｊ在 Ｓ Ｃ
１２ 实验 细胞 ． 大鼠胸大 动脉 Ｖ ＭＣ （ ７５ 购 于中 Ｓ ｓ Ａ ｒ） 国科 学院上海 细胞库 。经 传代 培养 后随机 分 为两组 ： 对 照组和钙化组 ； 实验第 １ ６天将细胞 培养至长满瓶 ～ 底 ， 细胞 密度为 １ ・ ｍ～， 测 ０ ｍ 对照组 给予正 常对照 的 Ｇ Ｍ培养基 ３ｍ ， ＭＤ Ｌ 钙化组给予 Ｎ Ｈ Ｐ ａ Ｏ 配制浓度 为
１ 材料与方法 １ １ 实验 材料 ． Ｎ Ｈ Ｐ 自天 津 市永文 化学 试剂 ａ Ｏ 购
用 改 良酚试 剂 法 ， 测 其 中总 蛋 白含量 。并 转 移 至 检 ＰＤ Ｖ Ｆ膜上 ， 应用 ５ ％脱 脂奶粉 封闭 ， 随后 置于 Ｉ３ Ｐ ＲＩ
抗 中。室温洗膜 ， ３次 。之后置人二抗溶液 中 ， 共 抗 体结 合 区带 用 化 学 发 光法 检 测 定 量值 （Ｏ ＩＤ值 ） 将 ，
李芳， 李绍冰 ， 姚丽霞， 苑晓烨
河北省人 民医院老年病二科（ 石家庄 ００ ５ ） ５０ １
【 摘要】 目的 检测大鼠血管平滑肌细胞（ Ｓ Ｃ ） Ｖ Ｍ ｓ钙化过程中１４５三磷酸肌醇受体 Ｉ Ｉ Ｒ Ｉ） ，， 型（Ｐ 表达 ３
水平 的变化 。方 法 采用磷 酸二氢钠（ ａ Ｏ ） Ｎ Ｈ Ｐ 诱导大 鼠动脉 Ｖ ＭＣ 钙 化 ， 用 Ｗｅｔ ｎｂｏ 法及 实时荧光定量 Ｓ ｓ 应 ｓ ｒ ｌ ｅ ｔ 在 Ｖ ＭＣ Ｓ ｓ钙化 时 Ｉ３ Ｐ Ｒ Ｉ表 达 水平 明显 增 高 （ Ｐ＜ 反转 录 Ｐ Ｒ法测定 细胞钙 化 时 Ｉ３ Ｃ Ｐ Ｒ Ｉ表达 的 变化。结 果
达和骨样结构形 成 。Ｖ ＭＣ 表型转 化是 高血 压 、 脉 Ｓ ｓ 动 粥样硬 化 和 心 肌 梗 死 等 心 血 管 疾 病 的 共 同发 病 基
础 。三磷酸肌醇 （Ｐ ） 近年来逐 渐被 关注 的一种 Ｉ３ 是 细胞信号传 导 分子 ， 在许 多 的病 理状 态下 会 发生 Ｉ３ Ｐ
胞外配体与胞浆 膜 Ｇ蛋 白受体 或 酪氨 酸激 酶受 体结 合， 激活磷脂酶 Ｃ产生 Ｉ３ 后者主要刺激分 布在肌浆 Ｐ，
网、 内质 网的 Ｉ３ 使 钙通 道开放 ， 生瞬 间振荡和钙 Ｐ Ｒ， 产 波等复杂的胞浆钙浓度信 号 ， 作为 细胞 内 ｃ 释放通 ａ
道， ３ Ｉ Ｒ精确地调控胞 浆 内 ｃ “浓 度 的变化 ， 而发 Ｐ ａ 从 挥多种生物学效 应 。而 Ｉ３ Ｐ Ｒ参 与 细胞钙化 的发 病机
染 色 ，７ ３℃温箱 中孵 育 ３ ｉ， ０ｍｎ 弃茜 素 红染 料 ，Ｂ Ｐ Ｓ冲
．
２３ ． ９８
广东晖学 ２１ 年１ 月第３ 卷第２ 期 Ｇ ａｇｏｇ ｅｉｌｏｒ ｌ ｏ ２１， ｏ ３ ， ｏ ２ ０１ １ ２ ２ ｕｎｄｎ Ｍ ｄ ａＪｕ ａ ｃ ｎ Ｎｖ ０１ Ｖ１ ２ Ｎ． ２ ． ．
广东医学 ２ １ 年 １ 月 第 ３ 卷第 ２ 期 Ｇ ａ ｇ ｏ ｇＭｅ ｉ ｌ ｏ ｒ ａ ｏ ． ０ １ ｖ Ｉ ３ ， ｏ ２ ０１ ｉ ２ ２ ｕ ｎｄｎ ｄ ａ Ｊｕｎｌ ｖ ２１ ， ０ ２ Ｎ ． ２ ｃ Ｎ ．
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２３ ・ ９７
大 鼠钙 化 血 管 平 滑 肌 细 胞 Ｉ３ 表 达 的变 化 Ｐ ＲＩ
２ １ 大鼠 Ｖ ＭＣ ． Ｓ ｓ的形 态学改变 对照组 大 鼠 Ｖ Ｍ ｓ Ｓ Ｃ 呈梭形 ， 排列整齐 ， 未见钙 化点 ； 钙化 组 Ｖ Ｍ ｓ Ｓ Ｃ 呈梭形 或多 角 形 ， 列 紊 乱 ， 浆 内可 见 褐 色 钙 化 点。见 排 胞
图 １
表达大量 Ｉ３ 而 Ｉ３ 、 １ Ｐ Ｒ Ｉ， Ｐ ＲＩ １型则 表达很 局 限。细 Ｉ１
０Ｏ ） ． １ 。结论
Ｖ ＭＣ Ｓ ｓ的 Ｉ３ 表达增 强可能参 与 了细胞 钙化的发生。 Ｐ ＲＩ
【 关键词 】 磷 酸二 氢钠 ； 细胞钙化 ；１４ ５三磷酸肌醇受体 ； 管平滑肌 ，， 血
血管钙化是老年人常见 的一种异位钙 化的病理现
象， 它与心肌梗死 、 脑卒 中和猝死等心脑 血管疾患密切 相关 。血管钙化既 往被认 为是 一个 被动 过程 … ， 是老 年化导致 的血管退行性变化 。近年 的研究 显示血管 的 钙沉积 是类似 于骨形 成 的主动可调 节过程 ， 括血管 包
的改变 。但 细 胞钙 化 时 １ ４ ５三 磷酸 肌醇 受 体 Ｉ型 ，，
（Ｐ Ｒ Ｉ） 达 有 何 变 化并 不 清 楚。２ ０ Ｉ３ 表 ０９年 １ 至 ０月
比， 到 目的基 因表达 的相 对定量值 （ Ｑ值 ） 将 Ｒ 得 Ｒ ， Ｑ 值 用于统计分析 。
１ ５ 大 鼠 主 动 脉 Ｖ ＭＣ ． Ｓ ｓ蛋 白提 取 与 Ｗｅｔｒ ｌｔ分 ｓ ｎ ｂｏ ｅ
平滑肌细胞 （ａｃｌ ｏｔ ｕｃ ｅ ｓＶ ＭＣ ） ｖｓ ａ ｓ ｏ ｍ ｓｌ ｃｌ ， Ｓ ｓ 等钙 ｕ ｒｍ ｈ ｅ ｌ 化血 管细胞 向成骨细 胞表型 转换 、 骨相关基 质 的表 成
洗 ２遍 ， 将玻片取 出， 置于载玻 片上 ， 置在 １ ４ 放 ０× ０倍 显微镜下 照相。 １４ 实时 荧光 定量反 转 录 Ｐ Ｒ 法 Ｉ３ 物 序 ． Ｃ Ｐ Ｒ Ｉ引 列： 上游 引物 ５ 一Ａ Ｃ Ｇ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ａ一 下 游 ３， 引物 ５ 一Ｔ Ｇ ｃ ｃ Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ａ ３ 。将 标 本 加 Ｉ ＧＡ Ａ ＧＡ Ｇ ｃＡ Ｇ 入 反转 录反应液 中 ，２ 反转录 ５ ｉ，５Ｃ ５ｍ ｎ灭 ４％ ０ｍｎ ９ ｏ ｉ 活反转 录 酶。在将 反 转 录产 品加 入 Ｐ Ｒ反 应 液 中 ， Ｃ Ｐ Ｒ热循环参数 ：６ ４ ｍ ｎ 然后 三 步反 应 ：４ ３ Ｃ ９ ℃ ｉ， ９℃ ０ Ｓ５ ℃ ３ ，２ ３ ， ，８ ０Ｓ７ ％ ０Ｓ进行 ４ ０个循环 ， 于每个循环 的 第 ３步 即 ７ ％ ３ 收集荧光信号 。扩增完毕后 ， 入 ２ ０Ｓ 进 结果 分析界面 ， Ｇ Ｐ Ｈ为 内参照 基 因， 以 ＡＤ 与对 照组 相
胞质 内 ｃ “浓度升高引起 Ｒ Ｒ敏感 的钙库释放钙 ， ａ ｙ
２ ２ 大 鼠 Ｖ Ｍ ｓ的 Ｃ 含 量及 Ａ Ｐ活性 钙化 组 ． ＳＣ ａ Ｌ
ｃ “含量较对 照组 显著 增加 （ ａ Ｐ＜０ ０ ） 相对 于对 照 ．１ ， 组， 钙化组 的 Ａ Ｐ活性 显著增 高（ ００ ） Ｌ Ｐ＜ ． １ 。见表 １ 。
一
开发 中心 ； 碱性磷 酸酶 （ Ｌ ） Ａ Ｐ 检测 试剂 盒购 于南 京建 成 生物公 司 ； ａ Ｃ 定量 检测 试剂盒 购 于上海 沪峰 科技
有 限公司 ； ３ 检 测试 剂盒 （Ｃ一 ８ １ ） Ｉ ＲＩ Ｐ Ｓ ２ ６ ４ 购于 Ｓｎａ ａｔ
Ｃｕ 公 司， ｒｚ 随机 引 物 （ａｄｍ ｐ ｍ ｒ） ｒｎ ｏ ｒ ｅｓ 为美 国 Ｐｏ ｅａ ｉ ｒ ｇ ｍ 公 司产品。
２ｍ ｏ Ｌ的 Ｇ Ｍ培养基 ３ｍ 。 ｍｌ ／ ＭＤ Ｌ
Ｉ Ｄ值用 于统计分析 。 Ｏ １６ Ｅ ＩＡ测定大鼠主 动脉 Ｖ Ｍｃ ａ ． ＬＳ Ｓ ｓｃ “定量 分别 设 空 白孔 （ 白对 照孔不加样 品及酶标试剂 ， 空 其余各 步 操作相 同） 标准孔 、 、 对照孔 、 待测样品孔。在 酶标包 被 板 上标准 品准确加 样 ５ ， 测样 品孔 中先 加样 品 ０ 待 稀 释液 ４ ， Ｏ 然后再加 待测样 品 １ （ 品最终 稀 Ｏ 样 释度 为 ５倍 ） 。加样将样品加于酶标板孔底部 ， 尽量 不 触 及孑 壁 ， 轻晃 动混 匀。以空 白孔调 零 ，５ ｍ 波 Ｌ 轻 ４０ｎ