SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

实验六报告：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

1.研究背景及目的

根据自然界中普遍存在的电泳现象，以及实践应用的需求，科学家不断完善了电泳技术，从移界电泳法、垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱型盘状电泳到水平板型电泳。电泳技术广泛地应用于样品的分析鉴定。

蛋白质分子量的测定在理论和实践中具有很重要的意义，比如临床中对于尿液中蛋白质分子量的测定可以监测人体内的某些疾病（肾小管损坏、多发性骨髓瘤等）。这种需要促进了相关技术的发明。具体过程见原理。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。从活性电泳到变性电泳经过了很多思考。从活性如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用[1]。通过向样品中添加入巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异。SDS与蛋白质分子结合，不仅使蛋白质分子带上大量的负电荷，而且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的电荷差异和分子形状的差异。因此蛋白质在SDS-PAGE中的时迁移率主要取决于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此广泛应用于未知蛋白质分子量测定。

通过本次实验，学习和掌握垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法，进一步学习

和应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量。

2.原理

由于技术的发展，理论上可以通过测序测出蛋白质分子量的真值，但是实际操作过于繁琐，且生物大分子的数量级是KDa，实际中往往不需要特别精确。所以转向寻求其它方法，如果两种性质具有相关性，就会有相关理论基础和技术，发现分子量与迁移速率有关，于是寻找相关方面的技术。通过沉降平衡法测定分子量，但是需要很大的转速，且要考虑安全性和造价，于是舍弃；分子筛层析主要以分子量差异进行分离，可以用来测定分子量，但是需要很长的分离柱，分离速度较慢，还要测定OD值，操作麻烦，浪费时间，而且带来的经济效益也不是很大；与此同时，电泳技术也发展起来，电泳相对时间较短，造价低，可操作性强。电泳与分子量、分子形状以及所带电荷量有关，其中含有分子量，理论上就可行了，于是用电泳测定分子量。首要矛盾是消除电荷差异和分子形状差异，从数学上彻底消除电荷效应是不可能的，使带电量相同也不可能实现，只有使分子带上非常大的电荷量从而使分子间的电荷差异可以忽略。想到通过引入外来物形成复合物，定量引入，定量结合，且结合后分子间差异并未发生改变。关于引入负电还是引入正电的问题，蛋白大多为球状，若结合后仍未球状，静电结合不稳定；双亲性物质彻底结合后破坏空间

结构，所以引入负电，结合稳定。于是开始筛选阴离子去污剂，在众多的物质试验中，发现十二

烷基硫酸钠（SDS）具有很好的效果。

SDS通常与蛋白质以1.4:1的重量比结合，所引入净电荷量约为蛋白质本身静电荷10倍的静电荷，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS-蛋白质复合物，该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。

SDS-蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴在18Å的数量级，保持恒定，而长轴的变化正比于蛋白质的分子量。因此SDS-蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状不同对电泳迁移率的影响。

综上，SDS-蛋白质复合物的迁移率只与蛋白质分子量有关，研究表明蛋白质分子的电泳迁移率与其分子量对数呈线性关系，因此能够根据电泳迁移率的比对获得未知蛋白质分

子量大小。

3.仪器与试剂

3.1仪器设备

DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）、100μl微量进样器（上海医用激光仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；

3.2主要实验器皿

烧杯（50ml ×3）、大培养皿一套、100ml量筒、玻璃漏斗；

3.3实验材料

实验四麦清蛋白脱盐样品；

3.4实验试剂

实验试剂：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bis）、十二烷基硫酸钠（SDS）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵、甘油、巯基乙醇、异丙醇、溴酚蓝、考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、盐酸、乙酸、冰乙酸；

试剂的配制：

⑴分离胶贮备液：称取Tris 18.17克，SDS 0.4克，溶于水，用3N HCl调pH到8.8，水定容至100毫升，其中Tris为1.5M，SDS为0.4%。

⑵浓缩胶贮备液：称取Tris 6.06克，SDS 0.4克，溶于水，用3N HCl调pH到6.8，水定容至100毫升，其中Tris为0.5M，SDS为0.4%。

⑶Acr/Bis储备液：称Acr 30克，Bis 0.8克，加蒸馏水到毫升。

⑷10%过硫酸铵：过硫酸铵1克，加蒸馏水至10毫升，用时现配。

⑸TEMED：冰箱保存。

⑹Tris-HCl样品缓冲液（pH 8.0）：称Tris 6.05克，甘油50毫升，巯基乙醇25毫升，溴酚蓝0.5克，SDS 10克，溶于水，用HCl调pH为8.0，水定容至500毫升。

⑺电极缓冲液：称取Tris 3.03克，甘氨酸14.41克，SDS 1.0克，溶于水，定容至

1000毫升。

4.操作步骤

4.1电泳槽的安装

玻璃板要先用洗液浸泡，然后用热水冲洗，再用蒸馏水冲洗，直立干燥，洗净的玻璃板装入硅胶夹套中，垂直的固定在两槽中间。在固定时，要四个螺旋对角线拧紧。电泳槽装好后，用溶化的电极缓冲液配配制的2%的琼脂注入高玻板一侧电泳槽的下方，从而封堵形成夹层胶室，以防漏胶，备下一步应用。

4.2制胶

分离胶的配制（T%=12.5%）

混匀，沿高玻璃板中央定点灌胶至距离矮玻璃板2-2.5厘米处，放正，立即沉稳轻缓封水层，静置聚合；聚合后倒去水层，以滤纸条吸干残余水层，灌注浓缩胶。

浓缩胶制备:

浓缩胶灌至与矮玻璃板顶端相齐，立即插入梳子，静置聚合。浓缩胶聚合后，灌注电极缓冲液，再拔出梳子，准备上样。

4.3样品的处理

Marker：市售标准样品按要求制备

待测样品：麦清蛋白初步提取的凝胶过滤脱盐实验所获得的峰值管制备的SDS-PAGE样品。

所有样品于沸水浴中加热5分钟，冷却后上样。

上样量：marker20ul，待测样品：4ul、10ul、20ul、30ul、50ul。

4.4电泳

样品加入后，准备电泳，本次实验：取稳流状态，浓缩胶15mA，分离胶25mA。本次试验的溴酚蓝前沿指示剂不能跑丢！

4.5检测

（1）染色液：0.4%考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，7%乙酸

（2）脱色液：20%甲醇，7%乙酸

（3）步骤电泳后，取出胶板，先在自来水中浸泡10min，以浸出部分SDS，（加热2h应该在通风橱中操作），然后用脱色液脱至条带清楚，观察记录结果。

4.6测量蛋白质样品的迁移率和未知样品的分子量

用卡尺或坐标精确测量溴酚蓝和各种蛋白质迁移的距离，把溴酚蓝迁移的距离定为d1，蛋白质迁移的距离定位d2，根据下面的公式计算各种蛋白质的迁移率Rm：Rm= d2/ d1