外源蛋白表达简介

二、杂交瘤技术的基本原理
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免
疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象 骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异 性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。
杂交瘤细胞的制备
（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基

骨髓瘤细胞选择
动物乳腺组织
• 分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白 质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特 别适合药用蛋白的生产；
• 转基因动物制作花费巨大，实验周期长
哺乳动物细胞表达系统
• 指导蛋白质正确折叠； 提供正确的多种翻译后加工功能； 表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近天然的高等生物蛋白质分子； • 可进行分泌表达 • 表达量不够高，培养成本较高
其
他
乳酸菌 (Lactic acid bacteria) 沙门氏菌 (Salmonella typhimurium) 苏云金杆菌 (Bacillus thuringiensis)
真核细胞表达体系
酵母细胞 昆虫细胞 植物细胞/组织 哺乳动物细胞/组织
酵母细胞
• 可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修 饰功能；可进行染色体整合型基因表达; • 糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓 度高; • 商品化表达体系： 酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 毕氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe）
（四）细胞准备
（1）收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不少于90％)； （2）收集小鼠脾细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，并计细胞数和测定活力细胞；
（3）按1：5或1：10混合脾细胞和骨髓瘤细胞后，离心弃去上清，并以消毒滤
净多余上清。
纸吸
（五）细胞融合
(1)将1ml 40％的PEG液一滴滴加入列细胞团中，在60秒内加完，同时并不断轻微 转动离心管或用手指轻弹离心管； (2)在不断转动离心管中加1ml无血清培养液，60秒钟内加完； (3)于5分钟内慢慢加完20ml无血清培养液；此时细胞对机械损伤非常敏感，
昆虫细胞
• 可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在 体外培养细胞SF-9中生产蛋白; • 适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰； • 糖链有所区别，表达量有限； • 作为药物宿主细胞未被FDA认可
植物组织
• 植物可大面积种植，可以廉价大规模生产； • 转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难 控制； • 表达量较难提高，分离纯化不方便
获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗
原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的； 大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接
种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹
水是很困难的。
单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：
• 特异性，与一个抗原决定簇反应； • 可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂； • 一经制出，可无限量地供应；
• 制备原理 要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体 的单克隆B淋巴细胞，但这种B淋巴细胞不能在体 外生 长。而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖 ，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞(次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型)与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种 细胞继承两种亲 代细胞的特性，它既具有B淋巴细 胞合成专一抗体的特性，也有骨髓瘤细胞能在体外 培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融合细胞 培养增殖的细胞群，可制备抗 一种抗原决定簇的特 异单克隆抗体。
细胞培养（传代过程）
T25 T75 T150 nT150
（静态悬浮或贴壁）
①转瓶培养（贴壁） 小转瓶 双层转瓶（大转瓶） ②酯片灌流培养（贴壁） 小转瓶 NBS罐 ③罐培养（悬浮） Spinner B.Braun罐 Bio罐 ④激流反应器（悬浮） 摇瓶 激流反应器
Roller Bottle、方瓶和三角摇瓶
(4)离心(800转／分，8分钟)，去上清，用完全培养液10ml悬浮，轻轻混匀；
(5)取96孔板，每孔加50l； (6)取等体积细胞悬液，向另一96孔板中加50P1； (7)送入5％CO2，温箱中37℃培养，24小时后更换成HAT选择性培养掖。
（六）融合后细胞培养
(1)融合后7—10天用HAT培养液半量换液(留一半旧的加一半新的) 后每隔2—3天 半量换液一次；
•骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体 •次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-） •胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）

选择性培养基-HAT培养基
•次黄嘌呤（hypoxanthine，H）; •氨基喋呤（aminopterin， A）; •胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine， T）
（二）免疫小鼠
• 生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；
（八）单克隆抗体的大量制备
体内法：鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂 交瘤细胞
诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞
在鼠类中诱生腹水是很困难的。培养法：杂交瘤细胞是半悬浮状来自的细胞；微载体贴壁式培养；
无血清悬浮培养
基因工程药物
• 基因工程载体构建 • 转染 • 筛选高表达克隆 • 细胞放大培养 • 蛋白提取纯化
哺乳动物细胞表达外源蛋白
• 单克隆抗体 • 基因工程药物
一、何谓单克隆抗体？
• 基本概念 抗体主要由B淋巴细胞合成。每个B淋巴细胞有合成一种抗体 的遗传基因。动物脾脏有上百万种不同 的B淋巴细胞系，含 遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺 激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因 的B细胞。被激活的B 细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克 隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种 抗体。 • 如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得 到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。 • 单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体，称为单克隆抗体（ monoclonal antibody,McAb）。
免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强
免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，
要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。 抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为loog，第二次为 50g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每 次腹腔注射1×l06一1×107。
(2)两周后可改用HA培养液半量换液，或仍用HAT培养液；
(3)2—3周后出现杂交细胞集落，细胞个大、圆且透明；
(4)待集落增殖生长至1／3孔时，应进行抗体检测。
（七）抗体检测
免疫荧光试验 放射免疫试验(RIA)
联免疫吸附试验(ELISA)
人源单克隆抗体主要困难
缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细胞株大多是融合率不 高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；
（三）脾细胞的制备
(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；
(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次；
(3)把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中； (4)在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗， 令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养 液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可； (5)把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中 置5分钟； (6)离心(800一1000转／分)计数、备用。
外源蛋白质的表达
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为什么要重组基因表达？
1. 2. 3. 4. 5. 6. 蛋白质功能研究 生物制药和疫苗生产 疾病的基因治疗 食品、化工用酶制剂 抗虫、抗逆植物改良 细胞代谢产物的富集
基因表达体系
1. 原核体系 2. 真核体系
大肠杆菌 (Escherichia coli)
• 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商 品化表达载体种类齐全，表达效率高； • 不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、 缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分 泌机制和充分形成二硫键的能力。
枯草杆菌 (Bacillus subtilis)
• 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结 构； • 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性 高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； • 质粒不稳定，尚无商品化的表达载体