第三章 血液分析仪检验

第三章血液分析仪检验

通过本章节学习，你将能回答关于“血液分析仪检验”的下列问题：

自动血液分析仪（automated hematology analyzer，AHA），早年称血细胞计数仪（blood cell counter），已是目前国内外临床检验最常用的筛检仪器之一。传统手工法显微镜血细胞计数或分类方法，不仅速度慢，而且因操作过程的随机误差、实验器材的系统误差和检测方法的固有误差，检测的精密度不高。在应对检查大量临床标本时，显微镜细胞计数法难以满足临床及时诊断疾病的需求。20世纪50年代初，美国W.H.Coulter申请了粒子计数法的技术专利，在世界上研发了第1台电子血细胞计数仪，并应用于临床，开创了血细胞计数的新纪元。从此，随着基础医学和高科技，特别是计算机软件技术的发展，其检测原理逐渐完善，检测技术不断创新，检测参数显著增多。“精度高、速度快、易操作、功能强”是血液分析仪的强劲优势，还可与血涂片制备和染色仪进行组合，由后者完成血液分析仪检测后的形态学复检。现代血液分析仪的功能还扩展到检测体液红细胞、白细胞计数和分类。当前，应用多项检测原理的血液分析仪问世，为临床不同层次需求提供了有效的血细胞检测参数，对疾病诊断与治疗有着重要的临床意义。

现代血液分析仪的功能有：①全血细胞计数功能（红细胞、白细胞和血小板计数及其相关的计算参数）。

②白细胞分类功能（3分群或5分类白细胞百分率和绝对值）。③血细胞计数和分类功能的扩展功能，包括：有核红细胞计数、网织红细胞计数及其相关参数检测；未成熟粒细胞、幼稚粒细胞、造血干细胞计数；未成熟血小板比率；淋巴细胞亚型计数；细胞免疫表型检测等。

第一节检测原理

现代血液分析仪主要综合应用了电学和光学2大原理，用以测定血液有形成分（细胞）和无形成分（血红蛋白）。电学检测原理包括电阻抗法和射频电导法；光学检测原理包括激光散射法和分光光度法。激光散射法检测的对象有2类：染色的和非染色的细胞核、颗粒等成分。

一、电阻抗法

（一）血细胞计数原理

悬浮在电解质溶液中的血细胞相对于电解质溶液为非导电颗粒，其电阻比电解质溶液大。利用两者导电性能的差异，当体积大小不同的血细胞（或类似颗粒）通过计数小孔时，可引起小孔内、外电流或电压的变化，形成与血细胞数量相当、体积大小相应的脉冲电压，从而间接区分出血细胞群，并分别进行计数，这就是电阻抗原理（principle of electrical impedance），即库尔特原理（Coulter principle）（图3-1）。

图3-1 电阻抗细胞计数原理

电阻抗法可准确测量出细胞（或类似颗粒）的大小，是三分群血液分析仪的主要应用原理。电阻抗法还与光学检测原理组合应用于五分类血液分析仪中。

（二）三分群血液分析仪基本组成

三分群血液分析仪基本组成见表3-1。

表3-1 三分群血液分析仪基本组成

二、射频电导法

射频（radio frequency，RF）指射频电流，是每秒变化大于10 000次的高频交流电磁波。电导性（electrical conductivity）即电的传送性能。高频电流能通过细胞壁。用高频电磁探针渗入细胞膜脂质层可测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质（如比例）、颗粒成分（如大小和密度）等特征性信息（图3-2）。电导性特别有助于鉴别体积虽相同、但内部结构性质不同的细胞（或相似体积的颗粒）；如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞两者直径虽均为9～12μm，但在高频电流检测时，因两类细胞不同核质比例而出现不同的检测信号。射频电导法结合其他检测原理一起应用于血液分析仪中。

图3-2射频电流检测原理

三、激光散射法

（一）基本检测原理

激光散射法应用了流式细胞术（flow cytometry，FCM）检测原理。

1．流式细胞术光散射理论目前，细胞分析应用Mie同质性球体光散射理论（Mie theory of light scatter for homogenenous spheres）。即：当光散射符合“2λ/π＜D＜10λ/π”（λ，入射光波长；D，球形物体直径）时，则测定光照射在颗粒上所形成的光散射强度的公式是：

S＝Ｆ（λ，α，τ，φ，β）

其中，S：散射光强度；λ：使用波长；α：折射率；τ：容积；φ：检测角度；β：形状因子。

2．流式细胞术检测原理将经试剂稀释、染色、球形化的细胞（或其他颗粒）悬液注入鞘液流中央，单个细胞随悬液和鞘液流两股液流整齐排列，以恒定流速定向通过石英毛细管（图3-3）。当细胞（或其他颗粒）通过激光束被照射时，细胞（或其他颗粒）因本身的各种特性（如体积大小、染色程度、细胞成分浓度或细胞核密度等），可阻挡或改变激光束的方向，产生与细胞（或其他颗粒）特征相应的各种角度的散射光。置放在石英毛细管周围不同角度的信号检测器（光电倍增管）接受到特征各异的散射光。来自低角度散射光（或称前向散射光）的信息，反映细胞（或其他颗粒）的数量和表面体积大小；来自高角度散射光（或称侧向散射光）的信息，反映细胞（或其他颗粒）的内部颗粒、细胞核等复杂性。如细胞（或其他颗粒）用荧光染料染色，则染色后的细胞（或其他颗粒）被激光照射时，可产生不同波长的荧光散射，可用检测器接受散射荧光（图3-4）。将来自各种散射光的信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细胞（或其他颗粒）。激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时，比电阻抗法血细胞分群更准确。故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。

图3-3鞘流技术

（二）激光散射法系统基本组成

激光散射法系统基本组成见表3-2，图3-4。

表3-2 激光散射法系统基本组成

图3-4流式细胞术检测通道和光路系统

四、分光光度法

分光光度法检测原理遵循Lambert-Beer比色定律，即A= lg（I0/I）。其中，A是吸光度（absorbance），或称光密度（optical density，D）；I0是单色入射光强度，I为透过光强度。被检物质吸收的单色光量与有色溶液（或悬液）的性质、厚度和浓度有关。当液体性质和厚度固定后，则吸光度与液体物质浓度成正比。

分光光度法仪器的主要组成：单色光源、检测池和比色容器、光检测器。

三分群或五分类血液分析仪均用分光光度法原理测定血红蛋白：含有溶血剂的稀释液使红细胞溶解并释放出血红蛋白，血红蛋白与溶血剂中某些成分结合，形成一种稳定的血红蛋白衍生物，在特定的光波范围（530～550nm）下进行比色；吸光度的变化与血液血红蛋白浓度成正比。

目前，用于血红蛋白测定的溶血剂有2大类。一类是含氰化物的溶血剂，所形成氰化血红蛋白（HiCN），最大吸收峰在540nm，显色稳定。另一类是不含氰化物的溶血剂，如月桂酰硫酸钠血红蛋白（sodium lauryl sulfate，SLS）法，当用HiCN法校准后，其检测的优点是既可达到与HiCN法相当的精密度和准确性，又可避免HiCN法试剂对操作人员的潜在危害和对环境的污染。

五、血液分析仪检测参数原理

（一）血液分析仪检测参数原理

不同类型血液分析仪检验参数的原理不尽相同。高档仪器应用2种或2种以上检测原理，组合电学、光学、细胞化学等技术，在独特检测通道测定红细胞、血小板和白细胞系列的数量、亚类及相关参数（表3-3、表3-4）。

表3-3 血液分析仪临床常用检验参数基本原理和技术－白细胞系列