免疫学诊断技术

免疫学诊断技术

军事医学科学院附属医院陈建魁

主要内容：

第一节第二节第三节第四节第五节第六节抗原抗体反应免疫学检测常用标记技术免疫细胞的检测免疫分子的检测免疫相关基因的检测免疫学检测方法的应用

第一节抗原抗体反应

抗原抗体反应: 抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。应用已知抗体或抗原检测未知抗原或抗体，可以对感染性、非感染性致病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助诊断。

1、特异性

2、适合比例性

3、可逆性

抗原抗体反应的特异性：

一种抗原一般只能与由它刺激所产生的抗体结合，这种抗原抗体结合反应的专一性即特异性。抗原抗体结合力的大小，常用亲和力(affinity)或亲合力(avidity)来表示。亲和力是指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度。亲合力是指整个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。

适合比例性：

抗体含量

抗原含量

前带

等价带

后带

在抗原抗体特异性反应时，当抗原与抗体达到最适比例时，沉淀物形成最多。如果抗原或抗体极度过剩则无沉淀物形成，这种现象称为带现象。出现在抗体过量时，称为前带。在抗原过量时，称为后带。

抗体过剩

抗原抗体比例合适

抗原过剩

网格学说（lattice theory）

可逆性：

Ag+Ab

K（亲和常数）=

Ag Ab

抗原抗体反应的影响因素

1、电解质浓度

2、酸碱度（pH: 6～8）

3、温度（37～42℃）

抗原抗体反应类型：

根据抗原性质、出现结果的现象、参与反应成分的不同，可将抗原抗体反应分为：凝集反应沉淀反应补体参加的反应采用标记物的抗原抗体反应等

颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合后形成凝集团块，这一类反应称为凝集反应(agglutination)。该类反应可检测到ug/ml水平的抗体。

1. 直接凝集反应

细菌或红细胞等颗粒性抗原

抗体

2. 正向间接凝集反应

载体颗粒

可溶性抗原例如，用γ球蛋白包被的胶乳颗粒,检测病人血清中的抗人γ球蛋白的抗体(类风湿因子)。

3. 反向间接凝集反应

载体颗粒

抗体

可溶性抗原

可溶性抗原(如：血清蛋白质、细胞裂解液等)与相应抗体结合后出现沉淀物，此类反应称为沉淀反应(precipitation)。

液相沉淀反应

絮状沉淀反应环状沉淀反应

抗血清抗原+ —抗原抗体+ —

免疫比浊法：

在定量抗体中分别加入不同浓度的抗原，经一定时间后可形成免疫复合物。用浊度计测量反应液体的浊度，复合物形成越多，浊度越高，可根据标准曲线计算出样品中的抗原含量。该法快速简便，可取代免疫扩散法测定Ig含量。

凝胶内沉淀反应

免疫扩散技术免疫电泳技术

火箭电泳单向扩散试验对流电泳双向扩散试验免疫电泳

Ag Ab Ag

第二节免疫学检测常用的标记技术

免疫标记技术(immunolabelling technique)是指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质(胶体金、铁蛋白) 作为示踪剂标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观察、适合自动化检测等很多优点。广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。

根据标记物与检测方法不同，标记技术可分为:

免疫荧光技术放射免疫测定免疫酶标技术发光免疫分析免疫金标记技术

主要的免疫标记物

类别荧光素标记物FITC、藻红蛋白（PE）用途免疫组化免疫分析测定放射性核素酶3H、51Cr

、32P、125I、131I

免疫分析测定免疫组化免疫分析测定

HRP、AP

化学发光物Luminol 金属颗粒胶体金

免疫分析测定免疫组化免疫分析测定

用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待检标本中的抗原反应，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。

(一)免疫荧光显微技术

1 直接荧光法：将荧光素直接标记抗体，作标本染色。优点: 简便易行。缺点: 每检查一种抗原必须制备相应的荧光抗体。

2 间接荧光法：首先用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点: 敏感性高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检查。缺点：非特异性荧光容易增多。

3 补体结合免疫荧光法行示踪。在抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进

直接法

间接法

补体法

双标记法

(二)流式细胞术(flow cytometry，FCM)

免疫荧光技术应用于流式细胞仪,可对细胞的表面标志(抗原或受体)进行快速、精确的分析和自动检测, 并可将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)进行多信息分析，是生命科学研究领域广泛应用的一项新技术。

(三)荧光免疫测定(fluoroimmunoassay，FIA)

1.荧光偏振免疫测定：(fluorescence polarization immunoassay，FPIA) 荧光物质经偏振光蓝光照射而跃入激发态，在恢复至基态后可释放出光子，经偏振仪形成偏振光，测定其强度可得到样品中待测物质的浓度。主要用于小分子物质(特别是药物浓度)的测定。

2.时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluoro -immunoassay，TR-FIA) 镧系稀土元素具有较长的荧光寿命，用其标记抗原或抗体，并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可以消除非特异性本底荧光的干扰，所得信号完全是特异荧光，此法灵敏度高、特异性好。

3.酶联荧光免疫测定(enzyme linked fluoro -immunoassay，ELFIA) 应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物，经过酶解反应产生高强度荧光，可用荧光仪进行定量测定。

放射免疫测定法(radioimmunoassay,RIA)是用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测的技术。将放射性核素的高灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合,使检测的敏感度达pg/ml 水平。常用的放射性核素有125I和131I。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛等药物以及IgE等。

三、免疫酶标技术

以酶标记抗体(或抗原)用于免疫学检测，通过酶催化底物显色，对细胞或组织标本中的抗原-抗体复合物进行定位、定性分析；亦可根据酶催化底物显色的深浅程度，定量测定体液中抗原或抗体的含量。

(一)酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry,EIH) 通过酶解底物、显色来示踪抗原抗体结合物的存在部位。酶免组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长期保存。辣根过氧化物酶的底物二氨基联苯胺(DAB)的分解产物适于电镜观察。常用的方法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidin –biotin - peroxidase complex，ABC) ，过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP)和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法(APAAP)。

(二)酶免疫测定(enzyme immunoassay，EIA) 1.非均相酶免疫测定(heterogeneous enzyme immunoassay) 根据是否使用固相支持物作为吸附抗体(或抗原)的载体，可分为固相EIA和液相EIA两类方法。其检测的敏感度达ng~pg/ml水平。常用的固相EIA法是酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，此法以聚苯乙烯制品或NC膜等作为固相载体。

(1)双抗体夹心法：用于检查特异抗原。首先将已知抗体包被在酶联板上，加入待检标本，标本中若含有相应抗原即与固相上的抗体结合，洗涤去除未结合成分，加入抗原特异的酶标记抗体，洗去未结合的酶标记抗体，加底物后显色。一般而言，包被抗体和酶标记抗体是识别同一抗原上的不同抗原决定基的2种抗体。

(2)间接法：用于检查特异抗体。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。

免疫印迹法(Immunoblotting)：它将凝胶电泳与固相免疫结合，是把电泳分区的蛋白质转移至固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。此法能分离不同分子大小的蛋白质并确定其分子量，常用于检测病毒的抗体或抗原。

免疫PCR(immuno-PCR，IM-PCR) 是将免疫反应的特异性与聚合酶链反应(PCR)的敏感性相结