实验七 枯草杆菌蛋白酶活力的测定

实验七枯草杆菌蛋白酶活力的测定

学时数：4学时

一、目的：

学习测定蛋白酶活力的方法，掌握72型分光光度计的原理和使用方法

二、原理：

酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝与钨蓝的混合物）。酪蛋白经蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用分光光度计法测定。

三、器材：

试管、吸管、漏斗、恒温水浴、722型分光光度计等

四、试剂：

标准酪氨酸溶液（100ug/mL），碳酸钠溶液（0.55mol/L），酚试剂，酶液，10％的三氯乙酸

五、步骤：

1、绘制标准曲线

取试管7支，编号，按下表加入试剂。单位：（ｍL）

摇匀，置30℃恒温水溶中显色15min。用分光光度计在A680min 处测定680nm的光吸引值。以光吸引值为纵坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2、酶活力测定

取酶液1 mL，在30℃预热5min，吸取0.5%酪蛋白溶液2 mL置于试管中，在30℃水浴中预热5min后加入的酶液0.5mL，立即计时，反应8min后，由水浴取出，立即加入10％三氯乙酸溶液3mL放置15min，用滤纸过滤。

同时另作一对照管，即取酶液0.5mL先加入3mL10％的三氯乙酸溶液。摇匀，然后再加入0.5%酪蛋白溶液2 mL，30℃保温8min，放置15min，过滤。

取3支试管，编号，分别加入样品滤液、对照滤液和水各1 mL，然后各加入0.55 mol/L的碳酸钠溶5 mL混匀后再各加入酚试剂1 mL，立即混匀，在30℃显色15分钟。以加入的一管作空白，在680nm处测对照及样品的OD值。

3、计算酶活

1克枯草杆菌蛋白酶在30℃，pH7.5的条件下所具有的活力单位为：

（A样-A对).K.V/t.N

六、结果：