重组克隆的筛选

特点： 一般用抗性培养基做初级筛选， 只能保证有载体转入，不能 保证外源基因插入。
克隆的Amp抗性筛选
蓝白斑筛选
－－β半乳糖苷酶（Lac Z)的显色反应

一、α互补：LacZ由4个亚基构成；细菌表达一部分（无活性）， 载体表达一部分（无活性），合在一起构成有活性的LacZ,可分 解培养基平板中的底物X-gal,生成蓝色物质。（需要IPTG诱导表 达）－－蓝斑； 二、外源基因插入载体后，使载体部分LacZ失活，无法进行α互 补－－白斑。（√） 三、特点： 1、未转入载体的细菌也会形成白斑，需同时用抗性筛选；
重组克隆的筛选*
1、抗性筛选； 2、蓝白斑筛选； 3、酶切电泳筛选(*)；
4、PCR筛选；
5、测序验证； 6、表达筛选； 7、生物活性筛选。
抗性筛选
--质粒载体携带的筛选标记
1. AmpR （氨苄青霉素抗性）
2、TetR (四环素抗性）
3、KanR (卡那霉素抗性)



1、一次测序反应一般准确测定500bp左右(也有测准800bp,价格 贵）－－60元左右。 2、测定的序列靠近引物（起点）20~30bp不准，500bp后的序列 也不准。 3、（1）质粒测序： 测序引物公司提供 （2）PCR产物直接测序： 测序引物自己提供，理论上比质粒测序更可靠。 注意: A. 测序引物必须与模板完全配对；含有mix碱基的引物 一般不能测序； B. 测序引物长度一般为20个碱基左右，GC含量必须在 50％～60%左右。
用抗体检测目标蛋白：
Western blot（最准确） ELISA (可能会受到交叉反应的干扰）
生物活性筛选
酶：测定酶活；
亲和蛋白：与亲和底物作用。 其它的生物活性。
分子克隆流程



1、分析基因，载体特点； 2、设计克隆策略； 3、检测基因，载体的正确性； 4、制备感受态细胞，目的基因，载体； 5、连接，转化。 6、筛选克隆 （1）Amp抗性初筛； （2）PCR筛选（或酶切筛选）； （3）表达筛选（SDS-PAGE和亲和筛选）； （4）测序验证 （5）生物活性筛选。



2、无法确定基因插入的方向；
3、特殊：基因过小，且读框正确，可能无法使载体部分LacZ失 活，将产生α互补，产生蓝斑。
酶切电泳筛选(*)
一、选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA


片断的大小。 二、特点： 1、可鉴定外源基因的重组和插入方向。 2、结果可靠但操作比较麻烦； 3、无法检测基因内部的突变。
EcoR1和Xho1双酶切筛选
PCR筛选
1、通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组
质粒。
二、特点： 1、可用2ul菌液做模板，快速，方便，可批量
检测。
2、不能检测基因插入方向 3、不能检测基因内部突变。
测序验证
一、选取阳性克隆，送公司测序；
二、特点：
1、最可靠的检测方法。可确定基因 的重组，插入的方向，基因内部的突变 等。 2、价格贵，适于1～2个克隆的验证。
一. 测序图谱分析,判断测序结果可靠性
二. 测序序列的分析
源自文库
注意:
有时序列是反测的,需要先把序列反转后再
同源联配.(用Vector NTI)
表达筛选
一、SDS-PAGE筛选；
二、亲和筛选； 三、免疫筛选；
SDS-PAGE筛选

1、小量诱导表达； 2、全菌液裂解后进行SDS-PAGE电泳； 3、重组的表达克隆将在特定的位置出现 较浓的蛋白条带。（需加不诱导的对照） 特点： 1、可检测外源基因的表达。（一般基因 的插入，方向，读框都正确） 2、无法筛选不能有效表达的重组质粒。
亲和筛选
1. 50 ml菌液诱导表达， 2、超声破菌， 3、用少量亲和beads吸附上清； 4、SDS-PAGE检测，在特点位点将出现一条蛋白带。 特点： 1、适用于有亲和Taq的融合蛋白的检测；
2、比SDS-PAGE筛选更灵敏（富集），可靠；
3、比较麻烦。
免疫筛选