实验1-大肠杆菌的培养和分离

Step5：菌种的斜面保存
斜面培养基
⑤将接种环将单菌落取出，用划线法接种在斜面培养 基上，37℃培养24 h后，置于4℃冰箱中保存。
试管斜面培养基的制作
方法：将未凝固的含有琼脂的培养基加入试管中，灭菌 后将试管斜放，令其冷却，固体培养基即成为斜面。
平板划线分离法
①灼烧接种环
外焰
先灼烧后冷却：以免接种环温度太高，杀死菌种。
（2）获得纯净微生物培养物的关键是 防止被杂菌污染 ，为 此，必须对培养器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培 养器皿和培养基一般采用高压蒸汽灭菌 法灭菌，接种环采用 灼烧法灭菌。同时在接种或倒平板操作时，除了在超净台上 进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和 消毒外，还必须 保证操作过程在酒精 以防止空气中的杂 灯火焰旁进行 菌污染。 （3）大肠杆菌菌种的扩大培养一般采用液体培养基，接种 后将培养基置于37℃摇床振荡条件下培养12 h。菌种的分离 一般在固体培养基上采用划线分离 法，并将培养皿以 倒置 状 态放置于适宜温度的恒温箱中，培养12～24 h 后， 将单菌落用接 ，接种于固体斜面培养基上，37℃培养 种环取出 24 h后，得到的纯化菌种在 4℃ 条件下保存。
枪头
棉花塞、封口膜、牛皮纸或旧报纸、橡皮筋
不能用脱脂棉：易吸水，容易引起污染。
酒精灯和酒精棉球
灭菌：杀死所有微生物。 消毒：杀死部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
超净工作台
防止杂菌污染
酒精灯火焰附近旁进行
灼烧灭菌 ①打开紫外灯和过滤风，灭菌30 min。 ②点燃酒精灯→酒精棉擦拭桌面→酒精棉球擦手。
超净台
②在酒精灯火焰旁将三角瓶中的固体培养基（冷却到60℃） 倒入灭菌的培养皿中，置于水平放置上，并轻轻晃动，待 凝固后形成平面。
Step3：接种后扩大培养
恒温摇床
③将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液 体培养基中，使其在37℃摇床培养12 h 。
Step4：平板划线分离
④用接种环在培养大肠杆菌的三角瓶中蘸取菌液一次，在 固体培养基的平板上连续划线。将培养皿倒置，放在37 ℃恒温箱中培养12～24 h。
用细菌过滤器除菌：尿素加热会分解，用G6玻璃砂 漏斗过滤。
什么是倒平板？
将灭菌后的固体培养基倒入已灭菌的培养皿中，冷却凝固后 制成的培养基。
Step1：培养基的配制和灭菌
无菌水 培养皿用牛皮纸包扎
①将50 mL LB液体培养基、50 mL LB固体培养基和培养 皿进行高压蒸汽灭菌。
Step2：倒平板
碳源
氮源
生长因子
水
维生素、氨基酸和含氮碱基
H2O，良好的溶剂
无机盐
NaCl：维持一定的渗透压
LB 培养基的配制
封口膜
LB固体培养基：蛋白胨 0.5g，酵母提取物 0.25g，氯化 钠 0.5g，加水50 mL，琼脂 1g。调节pH 至7.6。
菌落：单细菌的克隆
大肠杆菌 霉菌
菌落：在固体培养基上，由单个细菌繁殖而来的一个 肉眼可见的具有特定形状的子细胞群体。
第一章 微生物的利用
实验1 大肠杆菌的培养和分离
什么是微生物？
乳酸杆菌
黑曲霉
微生物：结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物。
什么是培养基？
培养皿
试管
三角瓶
凝固剂：琼脂
液体培养基：扩大培养，工业生产。 固体培养基：分离纯化，鉴定菌种，计数，保藏。
培养基的配制
营养成分 功能和来源 提供碳元素：主要是糖类 提供氮元素：蛋白胨、牛肉膏、尿素
菌落的作用：鉴定菌种的重要依据
菌落特征：菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。
大肠杆菌
大肠杆菌：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。
怎样无菌操作？
高压蒸汽灭菌锅
高压蒸汽灭菌：培养皿、试管、三角瓶、枪头、玻璃三 角刮刀、接种环、镊子。在121℃下灭菌15 min。
培养皿 三角瓶
微量移液器
接种环
玻璃三角刮刀
怎样在平板上划线？
1次
2次
3次
4次
连续划线法
分区划线法
为什么通过划线分离可得到单菌落？
原因：随着划线次数的增加，菌数越来越少，最终在划 线的末端出现由一个细菌繁殖而来的单个菌落。
恒培养时培养皿倒置
皿盖
皿底
培养皿倒置
恒温培养箱
原因：既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防 止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。
②滴加菌液
②用无菌吸管取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿
的固体培养基上。
③用玻璃刮刀涂布
玻璃涂棒
③将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待玻璃刮刀冷却后，在酒 精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个培养基表面。
④恒温培养箱中培养
恒温培养箱
④将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48 h。
10-1
②接种环冷却后，蘸取带菌培养物
③在近火焰处，让带菌接种环在固体培养 基上划线
④恒温培养箱中倒置培养
分区划线法
每次划线之前都要灼烧接种环。 总是从上一次划线的末端开始划线。
稀释涂布分离法
①梯度稀释菌液：10-5~10-7倍
①用无菌吸管吸取1mL细菌培养液加入另一个盛有9mL 无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。
10-2
10-3
10-4
10-5
结果：以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。
练一练，识一识
接种环
平板划线分离 玻璃刮刀
倒平板
稀释涂布分离
例题：要获得遗传特性单一的大肠杆菌菌种，一般必须对 原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养，并利用纯化技术得到 单菌落的菌种。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实 验的相关问题： （1）对买回来的大肠杆菌菌种进行扩大培养，一般用LB培 养基，在培养基中为微生物提供碳源、氮源和能源的物质 主要是 蛋白胨和酵母提取物 ，为调节渗透压，要加入一 定量的 氯化钠。为进行大肠杆菌的分离，还要加入 琼脂 配 制成固体培养基，并进行倒平板的操作。