小鼠睾丸组织分离分选

组织消化

1.取小鼠睾丸组织，放入1xPBS中，剥去白膜组织，用镊子轻轻撕开；

2.15ml离心管中加入6ml的消化体系：5.88ml DMEM + 120ul 胶原酶+ 3ul

DNAase；

3.37℃消化10min：其中消化5min时上下吹打10次，再继续消化5min；

4.消化期间，配制胰酶消化体系：取15ml离心管，加入

5.28ml DMEM + 600ul

胰酶+ 120ul 胶原酶+ 3ul DNase, 37℃预热；

5.消化完成的组织室温静置2分钟后期弃上清，加入预热后的胰酶消化液，上

下吹打10次后，放入37℃培养12min；

6.12min后，取出，上下吹打10次，继续消化12min；

7.将消化后的组织加入2ml的血清，终止消化，100um滤网过滤；

8.过滤后100g离心5min,弃上清，加入含10%FBS的DMEM，40um过滤，进

行镜检；

流式分选

1.镜检后的单细胞悬液，根据细胞量进行染：Hochest浓度：6ug/million细胞（我

们的Hochest浓度是10ug/ul），避光染色1h；

2.100g离心5min，弃上清；

3.加入2%FBS的1xPBS重悬细胞，进行上机分选，同时准备含10%FBS的

DMEM培养基收集细胞；

染色体铺展

1.分选出的细胞，400g,4℃，离心5min，弃上清，1xPBS重悬，并转移到1.5ml

的EP管中；

2.400g,4℃，5min，弃上清；

3.用染色体铺展的低渗Buffer重悬细胞，一般50ul重悬，室温放置30min；（低渗Buffer: 现用现配：250ul蔗糖溶液+150.15ul Tris+85ul柠檬酸钠溶液+50ulEDTA+2.5ulDTT+25ulPMSF, 补ddH20至5ml。以上所有溶液均配制的储存

液）

4.准备多聚赖氨酸处理过的玻片，玻片用之前在多聚甲醛Buffer中浸润；（PFA Buffer: 现用现配：称0.1gPFA加入10ml水中，100℃加热溶解，冷却后加入38.137mg硼酸钠和20ul Tritonx-100）

5.处理后的细胞，用20ul枪头轻轻吹打，滴加在浸润过PFA的玻片上，自然晾

干5h以上；

免疫荧光

1.将玻片放入12孔板中，用含5%BSA的PBS封闭1h；

2.弃封闭液，染1抗：1:200，染色1h, 350ul/孔，染色液：1xPBS即可；

3.用含0.1%Triton 的1xPBS洗3遍，5min/次；

4.染2抗，避光，室温1h, 二抗：1:1000, 350ul/孔（DAPI可在该步骤一起染，

1:1000）；

5.按上述同样步骤洗三遍

6.封片：取普通载玻片，滴加7ul封片剂，将含有细胞的玻片压在上面，注意

不要产生气泡；

7；待晾干后进行荧光检测

试剂及耗材的位置：

所有的抗体在4℃均有分装用的

消化的酶4℃分装用的也有，DNase在-20度

染色体伸展Buffer：用的几个试剂存储液在实验台上50ml离心管中存储，DTT 和PMSF在-20度存储

血清，培养基，1XPBS在4℃

PFA粉末在4℃

硼酸钠及Triton在实验台上

抗淬灭剂在4℃

包好的盖玻片在试验台抽屉中50ml离心管中，普通载玻片在实验台抽屉中