体外诊断试剂胶乳比浊法学习

胶乳免疫比浊法相关知识
很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目,关注胶乳标记技术得技术人员越来越多。

本人总结了部分胶乳微球标记技术,并加以分类,以便朋友们查阅:
胶乳微球物理吸附:
反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面得都就是疏水微球,都可以用来设计被动吸附蛋白。

磺酸基微球表面含带有负电荷得磺酸基团,pkａ大约为2,因此在酸性ｐH保持稳定。

醛基微球表面也带有磺酸基团,但能与蛋白行程共价键、羧基微球表面含带负电荷得羧基基团,在pＨ５.0以上时保持稳定。

带有疏水基团得蛋白得吸附与配位结合,就是最简单与直接得标记方法。

这种方法中,微球溶液与含目标蛋白得溶液混合,反应后,未结合得游离蛋白通过清洗步骤除去,从而获得胶体蛋白复合物。

疏水吸附方法只能用于疏水微球(硫酸盐、羧基、醛基表面修饰得微球)。

醛基表面修饰微球就是一个特例,其疏水吸附结果取决于后来得共价结合。

虽然物理吸附就是不依赖pH得,但反应缓冲液得pH对蛋白得结构有非常大得影响,从而影响蛋白吸附到微球上得反应效率。

一般,在被吸附蛋白等电点附近pH时,物理吸附效率会很高。

反应步骤:
1、用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml;
２、用反应缓冲液系数胶乳微球到１%;
3、将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中,10mｌ胶乳中加入1ml蛋白溶液。

室温搅拌孵育２hr;
4。

离心或超滤,除去未结合蛋白;ﻫ5。

将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。

注意事项:
1。

最优蛋白标记量影响因素
1)有效比表面积:粒径减小时,比表面积/mg微球值得增加;
2)胶体稳定性:蛋白对胶乳有稳定与去稳定作用;ﻫ３)免疫反应:最近标记量由免疫反应需要决定。

2、胶乳微球中加入蛋白后,快速搅拌混合,利于反应均衡、反应体积就是1ml时,可用移液器吸取蛋白加入微球中,并吹打数次。

如果反应体积较大时,用烧杯,边搅拌边加入蛋白,
３、储存缓冲液与反应缓冲液不同时,抗体有脱落得可能;ﻫ4.表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落,所以应避免加入。

ﻫ微球共价结合抗体方法:
一、一步法
１。

准备50ｍM pH６。

0得ｒeacｔｉｏn buffeｒ,醋酸或MＥS ｂuｆｆer更合适
2.用reａcｔｉｏｎｂuffeｒ溶解抗体,使其浓度为１mｇ/mL。

ﻫ３、用reａctiｏn buｆfer 悬浮微球,使其浓度为1％ｗ/v
4、边搅拌边将一倍体积得抗体溶液加入到10倍体积得微球悬液中,室温下持续搅拌２0分钟ﻫ５、准备浓度为10ｍg/ｍl(５2umol/mL)得EDC溶液,用前准备,现配现用、ﻫ６。

将计算需求量得EDC溶液加入到上述微球悬液中。

(Note６)。

7、室温下,立即调节pＨ(Ｎｏte 7)。

8、移除未结合得蛋白,并将包被微球用ｓtorage bufｆer重悬。

(Nｏte 3 and4)ﻫB. 两步法
为了避免EDC将相邻微球之间得蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流,两步法偶联抗体更合适、两步法中,在蛋白加入之前,多余得ＥDC被移除。

两步法中,蛋白也可以使用更高pH得ｂuffer来溶解,从蛋白得稳定性方面与加速蛋白与活化微球之间得交联速度方便考虑,就是非常有利得、
B1 简单一步法:
1、准备５0ｍＭpH6、0得活化ｂｕffer,醋酸或MＥS buffeｒ更合适;用活化buffer 悬浮微球,使其浓度为1% w/v
2.每ml微球悬液加入2０mg得ＥDＣ,室温孵育20分钟,然后再次加入２0mg/mL得EDC,继续室温孵育２0分钟。

(Ｎote 7).ﻫ3。

离心或超滤,用等体积得包被缓冲液清洗两次微球,最后悬浮在包被缓冲液中、(Notｅ3)。

ﻫ4。

用包被缓冲液溶解抗体到１mｇ/ｍL,包被缓冲液pH７~9,浓度为５0mM～１０0ｍM。

(Note 1)ﻫ5.将抗体快速加入得搅拌中得微球悬液中,持续搅拌,室温孵育2~5小时、(Nｏte ２).ﻫ6、每mｌ反应溶液中加入2。

５ｕl得乙醇胺,持续搅拌并室温孵育10分钟、(Note9).ﻫ7。

离心或超滤,用储存缓冲液悬浮,重复两次,移除未结合得抗体与乙醇胺。

(Note 3 aｎd４)
B２、NHS中间活化酯两步法
在此方法中,在EDAＣ存在下,ＮHＳ通过与微球上得羧基反应形成中间活化酯。

活化酯比EＤＣ更稳定,不易水解。

ﻫ1。

每ml反应混合物加入以下成分:
？加入DＩW,定容最终体积为1ｍl;ﻫ？0。

1mｌ10Ｘ得MEＳbufｆeｒ,ph6.０~6、5(10X得bｕ
0、1mｌ10％得微球(终浓度为1％);
ｆfer通常用０。

５M);ﻫ?
？０、２3mｌNHS水溶液(50mｇ/mＬ);11。

5mｇﻫ？一定体积得19、２ｍg/ml(100mM)得EＤAＣ水溶液;
2.室温下搅拌反应15～３0mｉn;(Note7)ﻫ3、清洗:MES buffer或ＤＩW清洗两次;(Noｔｅ3);
4.用DIW冲悬浮微球到浓度为1%;
5.同时,用包被ｂuffer溶解稀释抗体。

buｆfer一般为ph7～９,50mM~10０mM。

最终得蛋白浓度1mg/mL; ６。

清洗完微球后,立即加入一定体积得抗体溶液、(Note 2)。

(注意:此处给出得例子,微球浓度与蛋白浓度与buffer分别为0。

5％(w/v),0。

５mg/mＬ,25～５0mM);
７、室温下搅拌孵育２hｒ;
8、每ml反应液中加入2。

5mｌ乙醇胺,室温搅拌孵育10～３0miｎ;ﻫ9、清洗:stｏｒagｅbufｆer 清洗两次。

(Note３/４)
NＯTＥS:ﻫ1。

rｅacｔion ｂufｆｅr得组成根据蛋白种类得不同而改变,常用bufｆer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。

蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上,因为在等电点附近,蛋白表面会有更多得疏水位点暴露出来。

在这种情况下,抗体也更紧密,因此需要更多得抗体用于标记到微球上。

然而,最终reactioｎbufｆeｒ得选择,需要考虑最终抗体微球复合物得生物活性,因此,几个不同浓度得抗体与不同pH得反应ｂｕffｅｒ应该进行优化选择。

起始实验,反应buｆfｅr得离子强度应该在25～50ｍM。

2、蛋白溶液应该在快速得搅拌下,快速加入到微球悬液中。

小体积得话,可以进行斡旋混合。

当大体积时,应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些,蛋白溶液快速加入到漩涡中间。

3.移除未结合得化合物或蛋白,如果颗粒直径大于0.2um,可以通过离心得方法,微球可以重新悬浮,然后搅拌,接着温与得超声分散、离心力不宜过大,这样会导致微球不易分散。

也可以用超滤或透析来纯化。

当用超滤时,滤膜孔径应该足够大,使得游离得蛋白能自由得通过滤膜。

用于清洗微球得bufｆer应该与storage buffer一样、用于清洗得buｆfer得任何缓冲液成分及pH得改变,都会引起蛋白得脱落。

ﻫ4。

微球包被抗体后,加入表面活性剂或者去污活性成分,可能会导致抗体脱落。

如果就是共价结合到微球上,共价结合得抗体就不会有脱落现象发生。

封闭蛋白,像BSA,ｃaｓeiｎ或ｇｅｌatin可以用来封阻任何空余得疏水性位点,防止微球发生非特异性凝集。

但就是表面活性剂可以将那些共价结合不牢固得抗体洗脱下来。

ﻫ5。

此试剂与水反应,因此,溶解后应立刻使用掉。

６。

EＤC得用量,根据微球表面羧基浓度来计算。

根据计算所需量,每moｌ得羧基应该再多加2~３mo ｌ得EDC。

但就是,根据功能性检测结果,还需要进一步得优化。

ﻫ7.此步骤,微球得凝集经常能观察到。

因为接下来得步骤中,ＥDＣ会将相邻两个微球上得抗体连接起来从而引起微球凝集或者中与微球表面得羧基或者两者情况都发生、调节pH到６、5或超过6.５,优化共价反应,对微球得分散有帮助、如果反应结束后微球凝集现象仍然发生,用新鲜得bufｆｅｒ清洗除去多余得EDC与游离得蛋白,一般会使得凝集颗粒再分散、如果在最终得产品中凝集依然发生,尝试稀释微球,一开始可以稀释到原来得５0%浓度。

如果稀释后凝集依然发生,可以尝试在所有ｒｅacｔioｎbuffｅｒ中加入Tweeｎ20或Tergｉtol NP9等非离子型表面活性剂。

这些表面活性剂不会干扰颗粒得活性或共价结合,但就是需要注意得就是,要确保在这种去污剂存在下微球共价结合得抗体得稳定、ﻫ9。

加入乙醇胺,可以与加入蛋白反应后多余得羧基位基团反应。

胶乳标记过程中常见问题:
1)问题:蛋白无法吸附到微球上。

解决方法:加入更多得蛋白;去除微球中得表面活性剂,释放其占据得蛋白结合位点;引入中间物,将微球与蛋白相连;改变缓冲液、
２)问题:标记时加入了大量得蛋白,但就是仍然无活性。

ﻫ解决方法:改变蛋白加入量,从而改变蛋白与微球结合得空间构象;使用表位稀释物,占据微球上得部分蛋白结合位点,防止蛋白靠得太近。

3)问题:清洗去除未吸附蛋白后,微球聚集。

ﻫ解决方法:增加蛋白标记量或封闭剂得用量,防止有空余位点;
4)问题:标记后开始活性很好,储存一段时间后,活性降低。

解决方法:降低储存温度到２～８度;降低储存液中得封闭剂浓度,防止抗体被替换;确认储存液中无能与抗体竞争得杂质,防止长时间取代抗体。

5)PS微球与蛋白(抗体)交联后,当时没发现有凝集,但隔夜后发现有凝集ﻫ就是偶联效率低得原因。

当体系蛋白不足或就是其它原因,使微球表面在交联后还空出许多反应基团时,由于这些基团又可以与相连微球上得蛋白反应,结果就是把球又拉在一起了,所以有聚集、可以加一些bｌoｃker ａｇｅｎｔｓ解决,常见得就是BSA,另外,也可提高微球得交联率、
但为什么就是过一段时间后才出现凝集呢,这就是因为微球偶联上蛋白后,相互之间由于携带同种电荷得关系,比较稳定(所以能以胶体样存在),只有当偶尔相互碰撞,遇上彼此得反应基团时才能结合。

６)抗体偶联至羧基PＳ球,即时检测效果很好,但置于3７度2天后,抗体活性似乎下降很大、
可能共价结合未成功,如果就是这样,那么最主要得原因就是EＤAC质量差或过期了。

EDAC长期放在空气中会吸潮,水汽会降低ＥDAＣ活性。

另一个可能原因就是凝集。

观察胶乳就是否有凝集产生。

还有,交联蛋白前有没有清洗？我们提供得胶乳缓冲液中含有表面活性剂,可能干扰抗体得结合。

如果未发生凝集,而且用前已经清洗,那么我们建议换新得ＥDAC、
７)EDC活化羧基乳胶微球后,加蛋白(抗体)即时有沉淀出现,就是什么原因？
很多因素可以导致蛋白加入后,微球聚集成块。

通常,蛋白偶联前得聚集与缓冲液(电解质)有关。

可能就是羧基没有活化好。

ＥDC质量出现问题了,请换质量好得再尝试。

如果没有好得EＤC,可以适当调低活化缓冲液得pH值。

ﻫ对非修饰微球,那么可以从以下方面着手解决:
绝大多得微球制备过程中,加有脂肪酸乳化剂。

在聚合时,它起乳化作用,在聚合后,它起稳定剂作用,使微球以胶体样分布。

在碱性pH下,微球表面得CＯOH,脂肪酸分子上得COOH以及聚苯乙烯多聚链末端得硫酸根(SO４2—)使微球表面带负电荷,亲水性增强,从而能形成稳定得胶体。

ﻫ由缓冲液导致得聚集可以通过加蛋白,阴离子乳化剂,非离子乳化剂(如Triton X－100与Ｔweｅn-20)。

ﻫ下列方法供参考:ﻫa) 加入蛋白前,加少量得乳化剂。

具体量可以自己摸索掌握,太多得乳化剂可能会占据微球表面,影响蛋白偶联
b) 少数研究人员选择用含少量蛋白得缓冲液冲洗微球(可以降低体系中得离子强度)
c)适当降低缓冲液得浓度,但不能使蛋白变性。

ﻫd) 稀释微球,使微球间距离加大,减少相互结合得机会
e) 如果有可能,加大偶联蛋白得浓度ﻫf) 偶联时,将微球加入蛋白液中,而不就是将蛋白加入微球中
g) 偶联时,振荡加快反应
总之,其原则就是在微球与蛋白偶联前,减少其在高离子强度下与其它微球接触得机会。

在偶联结束后,由于微球表面接有得蛋白,会非常稳定。