细胞治疗用无血清培养基 - 中信药业

• CIK细胞培养：1640培养基，不同时间加入终浓度为 1000U/ml的INF-γ , IL-1α（终浓度为100U/ml）、IL-2 （终浓度为1000U/ml）和CD3单克隆抗体（终浓度为 50μg/ml）。 DC-CIK培养：用1640培养基GM-CSF、IL-4、LPS、 TNF-α、IFN-α、CD3-McAb、rh-IL-2
细胞治疗用无血清培养基国内外现状
邵 宁 生
CIK 和 DC细胞
CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer， CIK)是一种新型的免疫活性细胞，CIK增殖能力强，细胞毒作 用强，具有一定的免疫特性。由于该细胞同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分子，故又称为NK 细胞（自然杀伤细胞） 样 T 淋巴细胞，兼具有 T 淋巴细胞强大的抗瘤活性，和 NK 细 胞的非 MHC 限制性杀瘤优点。该细胞对肿瘤细胞的识别能力 很强，如同 “ 细胞导弹 ” ，能精确 “ 点射 ” 肿瘤细胞，但 不会伤及 “ 无辜 ” 的正常细胞。尤其对手术后或放化疗后患 者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和 复发，提高机体免疫力，因此， CIK 细胞被认为是新一代的肿 瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。 DC(树突状细胞)：一个独特的调控初始免疫反应的白细胞群落。
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相关研究
BMC Biotechnol. 2010 Sep 21;10:70. doi: 10.1186/1472-6750-10-70. Development of a serum-free medium for in vitro expansion of human cytotoxic T lymphocytes using a statistical design. Jeon MK, Lim JB, Lee GM. RESULTS: From a statistical analysis using the fractional factorial method, cholesterol and polyamine supplement were identified as positive determinants for cell growth. Their optimal concentrations were determined by the response surface method. The maximum viable cell concentration in the developed SFM was enhanced by more than 1.5-fold when compared to that in RPMI1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). Furthermore, a cytotoxicity assay and an enzyme-linked immunospot assay revealed that the effector function of cytotoxic T lymphocytes generated from PBMCs grown in SFM, by stimulation of peptide-presenting dendritic cells, was retained or even better than that in SCM. CONCLUSIONS: The use of a developed SFM with cholesterol and polyamine supplement for human lymphocyte culture resulted in better growth without loss of cellular function when compared to SCM.
天津美德太平洋科技有限公司
--CIK无血清细胞培养基:
由天津美德太平洋科技与美国斯坦姆再生医学研究开发中心共同合作利用" 人造血浆技术"开发的新一代拥有自主知识产权的美德斯坦姆无血清细胞培 养基系统可有效避免人畜共染疾病问题，同时无血清细胞培养基批间差异小， 培养条件容易保持一致，实验的重复性大为提高。培养基与试剂的成分，都 经过仔细地筛选，并且符合或超越最高规格国家执行标准。成品试剂成分均 达到或超过中国药典的标准。 产品特点： 1.同美国斯坦姆再生医学研究开发中心共同研发，并由其监控产品 质量； 2.开瓶即可使用的完全培养基，即可用于滋养层培养法，也可用于无滋养层 培养法； 3.最新配方，支持胚胎干细胞及诱导胚胎干细胞快速贴壁并大量增殖；不含 异源动物成份可有效避免人畜共染疾病问题 4.与同类产品相比，含有更低浓度的bFGF和TGFβ因子，不干扰细胞代 谢，不刺激细胞分化。
百恩维人免疫细胞无动物源培养基 经过测试对比，百恩维的免疫细胞无动物源培养基质量 远优于进口培养基，细胞增速、支持免疫细胞Marker、 杀伤能力等技术指标更胜一筹。 1、百恩维免疫细胞无动物源培养基(产品号：BW12002, 1000ml)的特点 适用范围广：适用于人体各种免疫细胞的无动物源培养。 培养性能优越：支持高密度细胞培养。 可维持细胞的高杀伤力。 质量保证：按cGMP标准生产，配制用水符合国家药监 局《人体细胞治疗研究和制剂质量控制指导原则》中注 射用水标准。
LONZA的X-VIVO TAKARA的GT-T551
都是非常好的无血清培养基，适合CIK、DC-CIK的培养都可用于临床。
Lonza
X-VIVO™培养基说明书 Lonza’s的努力和许多临床实验的合作已经证明lonza 有条件和技术推进免疫、癌症、基因和其他细胞治疗的发 展，lonza的宗旨就是用无血清组分在细胞治疗中为细胞提 供一个营养全面和平衡的环境，这里面不含任何外源性生 长因子，细胞增殖人工刺激物或者不确定成分。 这个产品避免了任何蛋白激酶c刺激物，适用于人类和 鼠淋巴细胞第二信使激活的研究，成分完全包含药用级的 人类白蛋白、重组人类胰岛素和经巴氏消毒的人转铁蛋白。 所有X-VIVO培养基都是在目前GMP条件下生产，并且通 过FDA认证，查询认证可联系产品经理。
CIK、 DC-CIK细胞无血清培养基
标准： • 可用于免疫细胞临床治疗研究的无血清培养基，
生产过程符合cGMP的标准规范。可用于人类体外 组织及细胞培养。 有效避免人畜共染疾病问题，同时无血清细胞培 养基批间差异小，培养条件容易保持一致，实验 的重复性大为提高。
使细胞大量增殖、不分化。
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常用国外公司产品
免疫细胞培养的一般操作步骤
CIK细胞培养： 1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）；或根据标准的外周血单个核细胞 解冻程序，在37°C的水浴，快速解冻（<1分钟）冷冻小瓶的外周血单个核 细胞 2、用生理盐水洗涤细胞，根据需要也可加入2-5％的热灭活的的人自体血浆。 3、计数细胞可以使用电子（即Coulter计数器，VI-细胞）或手动的方法（即血球 计数仪）。 4、离心细胞，清除洗涤缓冲液。 5、培养初期，用含细胞因子（如IL-2）的培养基重悬PBMC；CD3 + T细胞密度 保持在大约0.5-1×10 6/ mL。转移细胞到相应的细胞培养容器（培养袋、培 养瓶）。随后可应用各种操作激活T细胞，包括添加刺激的抗体或抗原抗原呈 递细胞。无论培养T细胞的规模大小，细胞均可被隔离，激活和扩大。 6、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱。在潮湿的气氛中，在37°C，5％CO2孵育 培养容器。在对数生长期细胞，需要维持细胞所需的浓度。为了保持细胞指 数生长期，当细胞密度超过1×10 6/ mL时，需要分离传代，维持细胞密度在 0.5-1×10 6/ mL（例如，2×10 6个细胞/ mL以上，按1:4比例0.5x106细胞/ mL）。在静态平板培养中为了获得最佳的气体交换，建议培养基深度不超过 1到1.2厘米。
存在的问题及我们的思路
存在问题： 国外产品价格昂贵，国内效果不佳。 医院大都使用有血清（胎牛）培养前几代，增殖到一定数目 后再用无血清培养基培养2-3代，洗涤后生理盐水分装。
我的建议： • 第一阶段：参照目前方法 • 第二阶段：购买品牌无血清培养基 • 第三阶段：改进型或自主创新型培养基
CIK细胞 、DC-CIK细胞培养基基本成分
免疫细胞培养的一般操作步骤
单核细胞树突状细胞(DC)培养： 1、准备新鲜的外周血单个核细胞（PBMC）。 2、将外周血单个核细胞在铺在培养瓶中，用加入25 mL免疫细胞无血清培养基。 3、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中孵育2〜3小时。 4、弃掉含非贴壁细胞的培养基。 5、用生理盐水洗涤贴壁细胞（主要是CD14 +单核细胞）三次。 6、往免疫细胞无血清培养基添加50至100 ng / mL的重组人IL-4和50 ng / mL的 重组人GM-CSF。细胞密度应介于1~3x105细胞/ mL之间。研究者可视情况 加入灭活的人自体血浆。 7、在37℃，5％CO 2的潮湿培养箱中连续孵育5天。培养3天左右换液。同时添 加IL-4和GM-CSF。 8、 6天之后，细胞表现出典型的树突状细胞的形态和表面标记（细胞CD1a， CD80，CD86，HLA-DR）。 9、向培养基中添加1μg/ mL的LPS或者50μl/mL的TNF-α诱导的树突状细胞的成 熟。
相关研究
Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2010 Apr;13(4):277-81. doi: 10.3779/j.issn.1009-3419.2010.04.01. [Biological characteristics and antitumor activity of CIK cells activated by recombinant human fibronectin for human lung cancer cell lines in vitro]. [Article in Chinese] Wang S, Du W, Zhang H, Wulan T, Zhang Y, He Y, Yang Y, Liu S, Zhang Z, Wang J. Source Department of Biotherapy, Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110032, China. sywang66@yahoo.com RESULTS: The RN-induced group had a higher proliferation rate that was 2.0-3.5 times of the conventional group, and there was an obvious statistical difference between the two (P < 0.05). The proliferation rates of CD3+CD16+CD56+T cells in each group were 3 778 and 2 068 times of the initial number, respectively. There was also a higher percentage of CD3+CD8+ T cells in RNinduced group (P < 0.05), while the percentage of CD3+CD4+T cells had no significant statistical difference (P > 0.05). We found a similar inhibition rate of the CIK cells to all this human lung cancer cell lines (P > 0.05). The cells which secreted IFN-gamma increased, while the cells which secreted IL-4 did not. The cells which secreted granzyme B and perforin were positive. CONCLUSION: It is an effective and simple way to cultivate the CIK cells with RN, which should be adopted.
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宝日医生物技术 (北京) 有限公司 Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd. GT-T551产品特点 :日本原装进口无血清培养基，适 用于人体淋巴细胞及DC细胞培养。 日本原装进口无血清培养基，已经加入人血白蛋白组 分 支持淋巴细胞的高密度细胞培养 在日本多家医院用 于临床治疗的细胞培养 配制用水符合国家药监局《人体细胞治疗研究和制剂 质量控制指导原则》中注射用水标准
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百恩维生物科技有限公司（Biowit Technologies）(深圳南山科技园 )，是一家专业从事 生物科技前沿技术研发的高新技术企业。为国内外众多药厂和科研机构提供病毒包装， 蛋白表达，载体构建，干细胞培养基，转染试剂、细胞因子等产品及技术服务。公司 专家团队曾在国内外知名学府和国际一流制药公司从事研发多年。