鱼类DNA提取方法

主要步骤如下：

（1）取50mg左右的经无水乙醇浸泡过的肌肉样品，用灭菌的牙签挑成细丝状，自然晾干。转入1.5ml离心管中，加入500μl DNA裂解液，加入5ml 20mg/ml蛋白酶K振荡混匀。55℃水浴保温2～3小时，每隔10min摇匀一次。

（2）加入等体积的Tris饱和酚，摇匀,用封口膜封好，37℃水浴2～3小时。每隔10min摇匀一次。

（3）10，000rpm离心10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1：1），摇匀5～10min。

（4）10，000rpm离心10min，小心转移上清液至一新离心管中，加入等体积的氯仿，摇匀5～10min。

（5）10，000rpm离心10min，转移上清液至一新离心管中，加入0.9倍体积的异丙醇以及0.1体积的3mol/LNaAc，摇匀1～2min。

（6）置于-20℃冰箱中3小时。

2.2鱼类总DNA的纯化

试剂：70％乙醇，无水乙醇，1XTE（Ph8.0）、1%琼脂糖。

（1）将2.2.1（6）的总DNA溶液，10，000rpm离心10min，去上清液，留下沉淀。用70％乙醇500μl洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击。重复此步骤一次。

（2）10，000rpm离心10min，去上清液，留下沉淀，加入500μl无水乙醇洗脱，剧烈摇匀，用手指弹击。

（3）10，000rpm离心10min，去上清液，把离心管斜置于超净工作台中，自然晾干。

（4）加入50μl 1XTE溶解DNA沉淀，用手指弹击，室温放置30min，取3μl DNA 用1％琼脂糖进行电泳检测。

（5）每个DNA样品分成两份，一份－20℃保存备用，另一份4℃保存进行下一步实验。

1.3.1 DNA的提取

总DNA的提取采用改进的高盐法。

1、取鱼背部肌肉约0.01g，挥发乙醇后放入1.5mlBuffer管中用无菌小剪刀剪碎，加入400μL SDS提取缓冲液和8μL20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55℃水浴锅中水浴2 h或者37℃过夜，中间震荡数次。

2、上清加入300μL的6M/L NaCl溶液，充分摇均，10, 000g/min 离心30 min。

3、本文中加一步：上清移入新管加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)混合液，摇均，10, 000g/min 离心10min。

4、上清移入新管加入等体积异丙醇，-20℃下沉淀1h以上，10, 000g/ min 离心10 min。

5、弃去上清液，沉淀用70%的酒精冲洗两次，无水乙醇洗一次。

6、室温下晾干，加入50μL TE溶液溶解。-20℃保存，备用。

1.3.2 总DNA电泳检测

取3μL DNA样品和1μL溴汾蓝buffer混合，用1%的琼脂糖凝胶在75V电压下电泳30min，EB溶液染色15~20min，电泳结果用凝胶成像系统观察照相。

1.3.3 PCR扩增体系与程序

PCR反应在UNOⅡBiometra仪上进行，PCR扩增引物序列为AFbL：5′-ACCG AGA CCAATGACTTGAARAACCACCGTTG-3′，AFbR：5′- CTTTGGGAGTTAG GGG TGGG AG-3′。

30 μL PCR反应体系包括：

10× Taq Buffer 3.0 μL

MgCl225 mM·L-1 3.0 μL

dNTPS 2.5 mM·L-1 2.4 μL

AFbL 20 mM·L-1 0.6 μmol/L

AFbR 20 mM·L-1 0.6 μmol/L

DMSO 1.5 μL

BSA 0.1mg/ml 1.0μL

Taq polymerase 0.9 U

DNA模板 1 -2μL(约10ng)

未足体积部分用无菌超纯水补足。

PCR反应程序为：95℃预变性3 min，然后95℃变性45s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共进行32个循环，最后72℃延伸10 min。反应设不含模板的反应液作空白对照，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测得到清晰谱带，产物纯化后在ABI 3730自动测序仪上用扩增引物双向测序。