鼻咽癌放疗敏感性的现状与策略

800
Dose(cGy)
Late S Early S G1 G2/M 1200
细胞增殖周期和放射敏感性的关系
• 细胞时相的敏感性差异
–M期最敏感 – G2期次之 –S期最不敏感 – G1/S期抗拒
• 照射后增殖周期中的细胞（时相）分布不同
14种鼻咽癌细胞株放疗剂量-生存曲线参数的比较
HNE1与CNE2敏感性差异的蛋白组学分析
• 组织细胞的蛋白组学研究
– 蛋白组学 – Western blot – 免疫组化（IHC）
• “ 彗星” 分析法（comet assay）
基础水平研究放疗敏感性
细胞水平检测鼻咽癌放疗敏感性 的 研究
方法一--------克隆形成试验
原理一个单细胞，形成了50个或更多细胞的 克隆细胞
– 线性二次模型拟合求出SF2、D0、Dq、N等放射 生物学参数
放疗结束复发或残存 时间
杂志
放疗敏感 放疗抵抗
6wHale Waihona Puke Baidu残存 且2m内无 复发
6 w不消退
Journal of Cellular Biochemistry (2010)
大于3y
小于3y
大于36个m 小于12个m
大于5Y 小于5Y
南方医科大学学报 2007
临床耳鼻咽喉头颈外 科杂志2007
Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys 2006
– TM0： 未照射的鼻咽癌细胞的尾力矩 – TM5：照射 5Gy的鼻咽癌细胞的尾力矩：
分子改变
方法
细胞株
杂志
作者
gp96 and GDF15 cDNA microarray analysis
DNA-dependent Clone formation
PK
assay
RKIP
Define time
HNE1,CNE2 CNE1,2 5-8F,6-10B
• “ 彗 星” 分析法检测敏感性
– 单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis 是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.
– 测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度， 头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参 数
• 用尾力矩之比( RTM ) 表示， 即RTM=TM5/TM0
Mol Cancer Ther 2007
Chang
Acta Physiologic Sinica，2007
Xia YunFei
Journal of Cellular Ruan Li Biochemistry (2010)
microRNA-17 QPCR
CNE1,2
J South Med Univ,2010
• 增敏治疗
– 化疗增敏 – 生物靶向治疗增敏 – 热疗增敏
• 基因治疗
• 改善肿瘤组织的缺氧
• 细胞凋亡诱导剂
（一）鼻咽癌的放疗增敏-----化疗
增敏治疗的药物分类
• 细胞毒性药物
– 健择、三氧化二砷、泰索帝
• 细胞周期阻滞剂
– 喜树碱衍生物拓扑替康、安卡胶囊、薏苡仁酯
• 抑制放射损伤修复能力的药剂
– 单个细胞集落形成效率PE PE=集落数/细胞总数×100% SF=计数所得克隆数/(接种细胞数×PE)
方法二：流式细胞技术检测肿瘤 细胞增殖动力学
G0期
G1期 S期
M期 G2期
处于不同增殖周期的细胞放射敏感性的 差异
Survival fraction
1.0 0.1 0.01 0.001
0
400
HNE1
CNE2
• 上调蛋白：6种
I 型角蛋白（type II cytokeletal 1） 、谷胱苷肽S转 移酶、磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase 1）、脂肪酸合成酶、 纤维母细胞生长因子受体 2前 体、 P73样肿瘤蛋白。
• 下调蛋白：3种
果糖二磷酸醛缩酶（Fructose-bisphosphateal aldolase A）、 II型角蛋白Keratin（type II cytokeletal 1）和 Myeloperoxidase
速逃逸有关。 （ Warenius，Radiat Res. 1996 （ • 晚G1期积累与 内源性raf-1蛋白的表达及内
在敏感性有关。 （Warenius Br J Cancer. 1998）
RAF-1蛋白与多种细胞株放疗敏感性
RAF-1与放疗敏感 性有关
RAF-1与放疗敏感性有关
第三部分 增强鼻咽癌放疗敏感性的策略
鼻咽癌放疗敏感性的困惑及对 策
肿瘤放射治疗的瓶颈
1.放疗敏感性的个体性差异 2.乏氧细胞造成的放疗抗拒 3.正常组织耐受量的限制 4.治疗不能解决潜在的远处转移
影响放疗敏感性的主要因素
肿瘤细胞的固有敏感性 是否乏氧，乏氧克隆细胞所占的比例 肿瘤放射损伤的修复
鼻咽癌的综合治疗
– 放射治疗 – 化疗 – 手术 – 生物靶向治疗 – 基因治疗 – 免疫治疗
（一）鼻咽癌的放疗增敏-----化疗
• 健择、三氧化二砷、泰索帝
• 姜黄素
• 血卟啉衍生物 (hematoporphyrinderiva．tive；HPD)、石 上柏、蟾蜍灵
（二）恶性肿瘤的放疗增敏-----热疗
• 热疗使肿瘤局部温度升高，循环加快，氧和度升高， 氧含量增加，敏感期细胞增多（因处于DNA合成期的S 期细胞对射线不敏感，但对热疗敏感。）瘤体中心乏 氧细胞减少，使放射线杀伤癌细胞效力增加，起到放 射增敏作用。
• 在哺乳类细胞中NHEJ是最重要的一种。 DNA-PK是NHEJ一个核心部分，是丝氨酸/苏 氨酸蛋白激酶，由催化亚单位DNA-PKcs和调 节亚单位Ku蛋白组成。
• 研究证实：Ku的功能是与DNA-PKcs组成 DNA-PK全酶，参与NHEJ进行DSB修复是Ku 的重要功能。
第一部分 放疗敏感性的判断方法
– 乏氧组织显像剂99mTc—HL91l 应用于诊断鼻咽 癌组织的乏氧情况，具有较高临床价值。
• PET-CT
– 反映肿瘤的解剖结构和代谢功能的改变
• 彩色多普勒超声
– 血供情况预测颈部转移淋巴结放疗敏感性。
血供丰富高于血供中等、血供贫乏者
临床判断放疗敏感性-------小结
• 根据放疗结束一定时间后的肿瘤残存率和 复发率来评价临床肿瘤的放疗敏感性，有 一定的指导价值。
G2-M阻滞对细胞周期分布的影响
关于RAF-1与放疗反应的关系
• 放疗抵抗性相关（观点一）
• 放疗敏感性相关（观点二）
c-raf-1与辐射抗性有关
观点一 • 体外转染c-raf-1和c-myc基因到人，不但可
形成肺癌，而且增加辐射抗性。 （Pfeifer A ，Biochem Biophys Res
CNE1与CN：E2 剂量-生存曲线参数的比较
CNE1敏感性低于CNE2
鼻咽癌细胞株(CNE1、CNE2)内在的辐射敏感性的差异原因之一 可能与其在经电离辐射后发生的G，期阻滞程度不同有关。
基因表达差异
辐射抵抗相关基因
辐射敏感相关基因
内在敏感性
影响放疗内在敏感性的基因及其功能
• 细胞凋亡 –促凋亡： p53,Bcl-XL, Bak
复发对鼻咽癌疗效的影响
放疗抗拒
转移
复发
失败
复发对鼻咽癌预后的影响
• 5年局部失败率为20%-40% • 局部复发原因占死亡率20%
DNA损伤修复
• 在真核生物，DNA损伤修复主要有两种途径， 即同源重组HR (homology-directed repair)和 非同源末端连接NHEJ(non-homologous end joining)。
素V
胞球)培养
临床肿瘤学杂志， 梁后杰 2008
蛋白水平直接检测放疗敏感性指示剂
• 多药耐药相关蛋白(MRP) 、Bcl-2、P53蛋白、血管内 皮生长因子C
– 放疗抗拒组比放疗敏感组高，提示与放疗抗 拒有关
• EGFR及 NF-Kβ
– 与鼻咽癌放射敏感性呈负相关
• PCNA， Ki-67 Cyclin D
–抑制凋亡：Bcl-2
• 细胞周期调节
• 肿瘤坏死因子
• 细胞增殖调节剂
• 细胞分化
基因的多态性与放疗敏感性
• 辐射抵抗型基因
– RAF基因 – DNA-PK – ATM基因
• 辐射敏感型基因
– P53 – RKIP
DNA的细胞核形态与放疗敏感性
核DNA含量与鼻咽癌放疗敏感性
“ 彗星” 分析法
Commun，1998）
RAF-1蛋白与辐射抵抗
• RAF-1蛋白在喉癌SQ-20B耐药有关 （1987,Science）
• RAF-1蛋白在肝癌HepG2耐药有关 （Oncol Rep，2004）
原癌基因c-raf-1与放疗敏感有关
观点二： • 原癌基因c-raf-1的表达与放疗敏感性有关
（Warenius， Eur J Cancer. 1994） • 表达c-raf-1的放疗敏感的人细胞与G2 期快
• 只能事后起着间接提示作用，它受到临床 分期、放疗剂量、贫血、肿瘤分化程度等 诸多因素的影响。
细胞分子水平预测放射内在敏感性
细胞分子水平研究放射敏感性的研究， 可以较好地预测肿瘤的内在敏感性，是
目前肿瘤放射敏感性研究的热点。
基础试验检测放疗敏感性
• 细胞水平研究
– Colony Formation Assays – Cell Cycle Analysis – Apoptosis Analysis
• 临床实践水平
– 回顾性判断 – 前瞻性预测
• 基础研究水平
– 细胞水平 – 分子水平
• 蛋白水平 • 基因水平（甲基化及乙酰化）
临床回顾分析敏感性
• 短期疗效
从单纯放疗开始至放疗结束后较短的时 间内，观察肿瘤残存率及消退情况。
• 长期疗效
复发时间的长短来判定肿瘤放疗的敏 感性。
分子表观
RKIP蛋白 MDR多态性 COX2蛋白 ----P53、VEGF蛋白
• RNA干扰技术抑制鼻咽癌细胞株（HNE1） RAF-1基因表达，发现凋亡率增加，其 mRNA表达下降。
（临床耳鼻喉头颈外科杂志，2006）
CD自杀基因治疗
• cytosine deaminase(胞嘧啶脱氨酶，CD) suicide therapy
YUAN Ya-wei
Tyrosine kinase Etk/BMX
多种蛋白
SUNE1etkSUNE1
双向凝胶电泳分 HNE1,CNE2 析及质谱分析
Cancer Biology & Therapy, 2011
中华放射医学与防 护杂志，2007
Zhenhua Zhang
王辉
实粘附分子整合 三维立体(多细 CNE2Z
大于5Y 小于5Y
癌症,2006
作者
Zhi-Qiang Xiao 袁亚维 刘阳云 Xia Yun-Fei
闵华庆
BCL-2 MRP蛋白
3y
12m
LN无残存 LN残存
Clin. Otolaryngol. 2004,
实用肿瘤学杂志， 2006
P.A. NIX 张建文
放疗前根据影像学表现预测敏感性
• SPECT断层显像
– 与放疗敏感性正相关
• TNF
– 肿瘤坏死因子促进细胞CNE2-S1放疗抵抗亚群的同步化作用， 增强鼻咽癌放射敏感性
蛋白分子水平
• endoplasmic reticulum (ER) stressinducible protein RP26内质网应激诱导蛋 白
• RAF蛋白
• RKIP蛋白
转染RKIP对鼻咽癌细胞凋亡的影响
• 热疗本身的作用与射线作用起着协同作用。
• 热疗在放疗前、中、后都起作用，最好的疗效是同时 进行（但实际中难以达到），一般在放疗后进行，温 度﹤42℃，时间60分钟，也可在热疗后半小时内放疗。
放疗加热疗作用机理
• 对放射线不敏感的S期细胞，对热敏感。细胞分 裂越快的肿瘤，对高热越敏感。
• 对于缺氧（慢性氧缺乏）、营养不良和低PH值环 境（酸环境）的肿瘤，对放射线敏感性差，但对 高热敏感。
• 加热疗后可减少放疗剂量（1/5---1/6左右）和放 疗次数，而不影响放疗的效应。
• 放疗可造成免疫抑制，热疗可激活免疫反应。 • 肿瘤对高热的敏感性是一致的，而放疗因肿瘤的
组织学类型不同而效应不同。
（三）鼻咽癌放疗增敏-----基因治疗
• P53 gene（今又生）
• RAF 反义寡核苷酸（AS ODN）
• cytosine deaminase（胞嘧啶脱氨酶） suicide , Egr-1 gene promoter ,hTERT gene promoter
• DNA-PK 反义寡核苷酸（AS ODN ）
– 逆转CNE1的辐射抗性
RAF-1基因治疗
• Raf-1基因反义寡核苷酸的脂质体注射液治 疗多种实体瘤I期临床试验已经取得令人鼓 舞的效（Clin Cancer Res. 2006）