HPLC同时测定丹参水溶性及脂溶性5种成分的含量_张慧娴
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Baidu Nhomakorabea
第 16 卷第 15 期 2010 年 11 月
中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 15 Nov. ，2010
中药丹参为唇形科植物丹参 （ Salvia miltiorrhiza Bge. ） 的干燥根及根茎，味苦，性微寒，归心、肝经，具 有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效［1］。 研 究 证 实 ，丹 参 主 要 含 有 脂 溶 性 和 水 溶 性 两 类 成 分 ，不 同 的 成分具有 不 同 的 药 理 活 性。 以 丹 参 酮 Ⅱ A 、隐 丹 参 酮、丹参酮Ⅰ为 代 表 的 丹 参 酮 类 脂 溶 性 成 分 具 有 天 然抗 氧 化［2］、抗 菌 消 炎［3］、抗 肿 瘤［4］和 心 血 管 药 理 作用［5］，以丹酚酸 B 为 代 表 的 酚 酸 类 水 溶 性 成 分 则 具 有 抗 心 肌 缺 血［6 ］、清 除 自 由 基 抗 氧 化［7 ］、抗 肝 脏 损 伤［8 ］、抗 神 经 凋 亡 改 善 记 忆 功 能［9 ］等 作 用 。
［关键词］ 丹参；迷迭香酸；丹酚酸 B；隐丹参酮；丹参酮Ⅰ；丹参酮Ⅱ A ；高效液相色谱法 ［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ B ［文章编号］ 1005-9903（2010）15-0034-05
Simultaneous Determination of Five Hydrophilic and Lipophilic Active Components in Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae by HPLC
ZHANG Hui-xian1 ，DU Shou-ying1* ，LU Yang1 ，CHEN Xiao-lan1 ， SONG Xiao1 ，LI Dong-xue2 ，XU Bing1
（1. School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China； 2. China National Center for Biotechnology Development，Beijing 100036，China）
［收稿日期］ 20100803 （003 ） ［基金项目］ “重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09502-008） ；“中 药 生 产 技 术 及 过 程 控 制 技 术 标 准 平 台 ”（ 2009ZX09308 -003 ） ； 教 育
部博士点基金（20090013110007） ［第一作者］ 张慧娴，在读硕士，专业方向中药制药专业；E-mail：zhxmay@ 126. com ［通讯作者］ * 杜守颖，教授，博士生导师；研究方向中药新剂型与制剂关键新技术；Tel：010 -84738615 ，E-mail：dushouying@ 263 . net
2010 年版《中 国 药 典 》将 丹 参 中 水 溶 性 成 分 和 脂溶性成分分 别 进 行 了 测 定，较 全 面 的 控 制 了 丹 参 质量，但方法较 繁 琐。 建 立 一 种 快 速、简 便、同 时 测 定 其 中 多 种 成 分 的 方 法 ，更 有 助 于 对 丹 参 质 量 控 制 。 由于丹参水溶性和脂溶性成分的紫外最大吸收波长 不相同，不宜在 同 一 波 长 下 进 行 测 定。 本 实 验 对 各 成 分 进 行 了 紫 外 全 波 长 扫 描 ，确 定 最 大 吸 收 波 长 ，采 用 HPLC 双波长 法，对 提 取 溶 剂 和 提 取 方 式 进 行 考 察 ，用 综 合 评 分 法 优 选 供 试 品 制 备 方 法 ，同 时 测 定 丹 参中 极 性 差 异 较 大 的 丹 酚 酸 B、迷 迭 香 酸、隐 丹 参 酮、丹参酮Ⅰ及丹 参 酮 Ⅱ A 含 量，该 法 简 便、准 确、重 现 性 好 ，灵 敏 度 高 ，可 用 于 丹 参 药 材 的 品 质 评 价 。 1 材料 1. 1 仪 器 LC-20AT 高 效 液 相 色 谱 仪 （ SPD-20A VWD 检测器，四 元 低 压 梯 度 泵，柱 温 箱，自 动 进 样 器； 日 本 岛 津 公 司 ） ，LCSolution 色 谱 工 作 站。 METTLER AE 240 型电子分析天平 （ 上海梅特勒-托 利多仪 器 有 限 公 司 ） ； Sartorius BS110S 型 电 子 分 析 天平（ 北京 赛 多 利 斯 科 学 仪 器 有 限 公 司 ） ； YP10002 型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。 1. 2 试药 丹参药材购自安国以岭中药饮片有限公 司 ，经 北 京 中 医 药 大 学 中 药 学 院 刘 春 生 教 授 鉴 定 为 唇 形科植 物 丹 参 Salvia miltiorrhiza Bge. 的 干 燥 根 及 根 茎 ；丹 参 酮Ⅰ、迷 迭 香 酸 对 照 品 购 自 南 昌 贝 塔 生 物 科 技 有限 公 司，含 量 测 定 用，批 号 分 别 为 10109-200811， 10309-200906；丹酚酸 B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 对照品 购自中国药品生物制品检定所，含量测定用，批 号 分 别为 11156-200605，110852-200305，110766-200518；乙 腈（ 色谱纯，加拿大 Promptar 公司） ；娃哈哈纯净水；其 他试剂均为分析纯（北京化工厂）。 2 方法和结果 2. 1 色谱条件 色谱柱 Dikma Diamonsil C18 柱（4. 6
第 16 卷第 15 期 2010 年 11 月
·化学与分析·
中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 15 Nov. ，2010
HPLC 同时测定丹参水溶性及脂溶性5种成分的含量
张慧娴1 ，杜守颖1* ，陆洋1 ，陈晓兰1 ，宋逍1 ，李冬雪2 ，徐冰1
（1. 北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2. 中国生物技术发展中心，北京 100036）
［摘要］ 目的：建立同时测定丹参中 2 种水溶性 和 3 种 脂 溶 性 成 分 的 HPLC 方 法。 方 法：采 用 C18 柱 （ 4. 6 mm × 250 mm， 5 μm） ，以乙腈（ A） -0. 05% 磷酸水溶液（ B） 为流动相进行梯度洗脱：0 ～ 27 min，20% ～ 25% A；27 ～ 55 min，25% ～ 80% A；55 ～ 65 min，80% ～ 80% A；检测波长为 270 nm 和 286 nm，柱温 30 ℃ 。结果：迷迭香酸、丹酚酸 B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ A 分别 在 1. 92 × 10 － 2 ～ 0. 96 μg，7. 29 × 10 － 2 ～ 3. 64 μg，3. 05 × 10 － 3 ～ 0. 15 μg，1. 71 × 10 － 3 ～ 8. 55 × 10 － 2 μg，5. 80 × 10 － 3 ～ 0. 29 μg 呈 良好的线性关系。加样回收率分别为 99. 88% ，104. 75% ，101. 08% ，101. 41% ，102. 41% 。结论：该含量测定方法准确、稳定、简 便，分离效果好，能同时测定丹参中迷迭香酸、丹酚酸 B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ A 5 种有效成分的含量。
［Abstract］ Objective： To develop a new method for simultaneous determination of two hydrophillc components and three lipophillc components of Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae. Method： The HPLC-double wavelength detection was employed using a column of Dikma Diamonsil C18 （4. 6 mm × 250 mm，5 μm） with a mobile phase of acetonitrile （ A） -0. 05% phosphoric acid （ B） . The gradient elution program was as follows：0-27 min，20% 25% A；27-55 min，25% -80% A；55-65 min，80% -80% A. The detection wavelength was set at 270 nm and 286 nm. The column temperature was at 30 ℃ . Result： Rosmarinic acid was linear in the range of 1. 92 × 10 － 2 -0. 96 μg； salviamolic acid B was linear in the range of 7. 29 × 10 － 2 -3. 64 μg；clyptotanshinon was linear in the range of 3. 05 × 10 － 3 -0. 15 μg；tanshinone was linear in the range of 1. 71 × 10 － 3 -8. 55 × 10 － 2 μg and tanshinone ⅡA was linear in the range of 5. 80 × 10 － 3 -0. 29 μg. The average recovery was 99. 88% ，104. 75% ，101. 08% ，101. 41% ，102. 41% respectively. Conclusion：The present method was simple and had satisfactory efficacy；it can simultaneously determine multiple hydrophilic and lipophilic bioactive components in Salvia miltiorrhiza from different areas.
mm × 250 mm，5 μm；柱号 8132893 ） ；流动相 A 相 为 乙腈，B 相为 0. 05% 磷 酸 水 溶 液，梯 度 洗 脱，洗 脱 程 序如下 0 ～ 27 min，20% ～ 25% A；27 ～ 55 min，25% ～ 80% A；55 ～ 65 min，80% ～ 80% A；隐丹参酮、丹参 酮Ⅰ、丹参酮 Ⅱ A 检 测 波 长 为 270 nm，迷 迭 香 酸、丹 酚酸 B 检 测 波 长 为 286 nm；流 速 1. 0 mL·min － 1 ；进 样量 10 μL。 2. 2 混合对照品配制 精密称取迷迭香酸、丹酚酸 B、隐丹参酮、丹 参 酮 Ⅰ、丹 参 酮 Ⅱ A 对 照 品 适 量，置 于 不 同 体 积 的 量 瓶 中 ，用 甲 醇 配 制 成 母 液 ，各 吸 取 一 定体积，配制 成 分 别 为 38. 4，145. 8，6. 1，3. 42，11. 6 mg·L － 1 的混合对照品溶液，摇匀，4 ℃ 避光保存。 2. 3 供试品溶液制备方法的建立 2. 3. 1 提取溶剂考察 取丹参药 材粉末 （ 过 50 目 筛）0. 3 g，精密称定，置于 100 mL 具塞锥形 瓶 中，分 别精 密 加 入 70% 甲 醇、80% 甲 醇、90% 甲 醇、纯 甲 醇、70% 乙醇、80% 乙 醇、90% 乙 醇 50 mL，称 重，加 热回流 1 h，放冷 后 用 提 取 溶 剂 补 足 质 量，提 取 液 经 0. 45 μm 微孔滤膜滤过，取续 滤 液，以 2. 1 项 下 色 谱 条件进行测定。
［Key words］ Salvia miltiorrhiza Bge. ；rosmarinic acid；salviamolic acid B；clyptotanshinone； tanshinone Ι； tanshinone ⅡA ；high performence liquid chromatography
Baidu Nhomakorabea
第 16 卷第 15 期 2010 年 11 月
中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 15 Nov. ，2010
中药丹参为唇形科植物丹参 （ Salvia miltiorrhiza Bge. ） 的干燥根及根茎，味苦，性微寒，归心、肝经，具 有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦之功效［1］。 研 究 证 实 ，丹 参 主 要 含 有 脂 溶 性 和 水 溶 性 两 类 成 分 ，不 同 的 成分具有 不 同 的 药 理 活 性。 以 丹 参 酮 Ⅱ A 、隐 丹 参 酮、丹参酮Ⅰ为 代 表 的 丹 参 酮 类 脂 溶 性 成 分 具 有 天 然抗 氧 化［2］、抗 菌 消 炎［3］、抗 肿 瘤［4］和 心 血 管 药 理 作用［5］，以丹酚酸 B 为 代 表 的 酚 酸 类 水 溶 性 成 分 则 具 有 抗 心 肌 缺 血［6 ］、清 除 自 由 基 抗 氧 化［7 ］、抗 肝 脏 损 伤［8 ］、抗 神 经 凋 亡 改 善 记 忆 功 能［9 ］等 作 用 。
［关键词］ 丹参；迷迭香酸；丹酚酸 B；隐丹参酮；丹参酮Ⅰ；丹参酮Ⅱ A ；高效液相色谱法 ［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ B ［文章编号］ 1005-9903（2010）15-0034-05
Simultaneous Determination of Five Hydrophilic and Lipophilic Active Components in Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae by HPLC
ZHANG Hui-xian1 ，DU Shou-ying1* ，LU Yang1 ，CHEN Xiao-lan1 ， SONG Xiao1 ，LI Dong-xue2 ，XU Bing1
（1. School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China； 2. China National Center for Biotechnology Development，Beijing 100036，China）
［收稿日期］ 20100803 （003 ） ［基金项目］ “重大新药创制”科技重大专项（2009ZX09502-008） ；“中 药 生 产 技 术 及 过 程 控 制 技 术 标 准 平 台 ”（ 2009ZX09308 -003 ） ； 教 育
部博士点基金（20090013110007） ［第一作者］ 张慧娴，在读硕士，专业方向中药制药专业；E-mail：zhxmay@ 126. com ［通讯作者］ * 杜守颖，教授，博士生导师；研究方向中药新剂型与制剂关键新技术；Tel：010 -84738615 ，E-mail：dushouying@ 263 . net
2010 年版《中 国 药 典 》将 丹 参 中 水 溶 性 成 分 和 脂溶性成分分 别 进 行 了 测 定，较 全 面 的 控 制 了 丹 参 质量，但方法较 繁 琐。 建 立 一 种 快 速、简 便、同 时 测 定 其 中 多 种 成 分 的 方 法 ，更 有 助 于 对 丹 参 质 量 控 制 。 由于丹参水溶性和脂溶性成分的紫外最大吸收波长 不相同，不宜在 同 一 波 长 下 进 行 测 定。 本 实 验 对 各 成 分 进 行 了 紫 外 全 波 长 扫 描 ，确 定 最 大 吸 收 波 长 ，采 用 HPLC 双波长 法，对 提 取 溶 剂 和 提 取 方 式 进 行 考 察 ，用 综 合 评 分 法 优 选 供 试 品 制 备 方 法 ，同 时 测 定 丹 参中 极 性 差 异 较 大 的 丹 酚 酸 B、迷 迭 香 酸、隐 丹 参 酮、丹参酮Ⅰ及丹 参 酮 Ⅱ A 含 量，该 法 简 便、准 确、重 现 性 好 ，灵 敏 度 高 ，可 用 于 丹 参 药 材 的 品 质 评 价 。 1 材料 1. 1 仪 器 LC-20AT 高 效 液 相 色 谱 仪 （ SPD-20A VWD 检测器，四 元 低 压 梯 度 泵，柱 温 箱，自 动 进 样 器； 日 本 岛 津 公 司 ） ，LCSolution 色 谱 工 作 站。 METTLER AE 240 型电子分析天平 （ 上海梅特勒-托 利多仪 器 有 限 公 司 ） ； Sartorius BS110S 型 电 子 分 析 天平（ 北京 赛 多 利 斯 科 学 仪 器 有 限 公 司 ） ； YP10002 型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。 1. 2 试药 丹参药材购自安国以岭中药饮片有限公 司 ，经 北 京 中 医 药 大 学 中 药 学 院 刘 春 生 教 授 鉴 定 为 唇 形科植 物 丹 参 Salvia miltiorrhiza Bge. 的 干 燥 根 及 根 茎 ；丹 参 酮Ⅰ、迷 迭 香 酸 对 照 品 购 自 南 昌 贝 塔 生 物 科 技 有限 公 司，含 量 测 定 用，批 号 分 别 为 10109-200811， 10309-200906；丹酚酸 B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA 对照品 购自中国药品生物制品检定所，含量测定用，批 号 分 别为 11156-200605，110852-200305，110766-200518；乙 腈（ 色谱纯，加拿大 Promptar 公司） ；娃哈哈纯净水；其 他试剂均为分析纯（北京化工厂）。 2 方法和结果 2. 1 色谱条件 色谱柱 Dikma Diamonsil C18 柱（4. 6
第 16 卷第 15 期 2010 年 11 月
·化学与分析·
中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol. 16，No. 15 Nov. ，2010
HPLC 同时测定丹参水溶性及脂溶性5种成分的含量
张慧娴1 ，杜守颖1* ，陆洋1 ，陈晓兰1 ，宋逍1 ，李冬雪2 ，徐冰1
（1. 北京中医药大学 中药学院，北京 100102；2. 中国生物技术发展中心，北京 100036）
［摘要］ 目的：建立同时测定丹参中 2 种水溶性 和 3 种 脂 溶 性 成 分 的 HPLC 方 法。 方 法：采 用 C18 柱 （ 4. 6 mm × 250 mm， 5 μm） ，以乙腈（ A） -0. 05% 磷酸水溶液（ B） 为流动相进行梯度洗脱：0 ～ 27 min，20% ～ 25% A；27 ～ 55 min，25% ～ 80% A；55 ～ 65 min，80% ～ 80% A；检测波长为 270 nm 和 286 nm，柱温 30 ℃ 。结果：迷迭香酸、丹酚酸 B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ A 分别 在 1. 92 × 10 － 2 ～ 0. 96 μg，7. 29 × 10 － 2 ～ 3. 64 μg，3. 05 × 10 － 3 ～ 0. 15 μg，1. 71 × 10 － 3 ～ 8. 55 × 10 － 2 μg，5. 80 × 10 － 3 ～ 0. 29 μg 呈 良好的线性关系。加样回收率分别为 99. 88% ，104. 75% ，101. 08% ，101. 41% ，102. 41% 。结论：该含量测定方法准确、稳定、简 便，分离效果好，能同时测定丹参中迷迭香酸、丹酚酸 B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ A 5 种有效成分的含量。
［Abstract］ Objective： To develop a new method for simultaneous determination of two hydrophillc components and three lipophillc components of Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae. Method： The HPLC-double wavelength detection was employed using a column of Dikma Diamonsil C18 （4. 6 mm × 250 mm，5 μm） with a mobile phase of acetonitrile （ A） -0. 05% phosphoric acid （ B） . The gradient elution program was as follows：0-27 min，20% 25% A；27-55 min，25% -80% A；55-65 min，80% -80% A. The detection wavelength was set at 270 nm and 286 nm. The column temperature was at 30 ℃ . Result： Rosmarinic acid was linear in the range of 1. 92 × 10 － 2 -0. 96 μg； salviamolic acid B was linear in the range of 7. 29 × 10 － 2 -3. 64 μg；clyptotanshinon was linear in the range of 3. 05 × 10 － 3 -0. 15 μg；tanshinone was linear in the range of 1. 71 × 10 － 3 -8. 55 × 10 － 2 μg and tanshinone ⅡA was linear in the range of 5. 80 × 10 － 3 -0. 29 μg. The average recovery was 99. 88% ，104. 75% ，101. 08% ，101. 41% ，102. 41% respectively. Conclusion：The present method was simple and had satisfactory efficacy；it can simultaneously determine multiple hydrophilic and lipophilic bioactive components in Salvia miltiorrhiza from different areas.
mm × 250 mm，5 μm；柱号 8132893 ） ；流动相 A 相 为 乙腈，B 相为 0. 05% 磷 酸 水 溶 液，梯 度 洗 脱，洗 脱 程 序如下 0 ～ 27 min，20% ～ 25% A；27 ～ 55 min，25% ～ 80% A；55 ～ 65 min，80% ～ 80% A；隐丹参酮、丹参 酮Ⅰ、丹参酮 Ⅱ A 检 测 波 长 为 270 nm，迷 迭 香 酸、丹 酚酸 B 检 测 波 长 为 286 nm；流 速 1. 0 mL·min － 1 ；进 样量 10 μL。 2. 2 混合对照品配制 精密称取迷迭香酸、丹酚酸 B、隐丹参酮、丹 参 酮 Ⅰ、丹 参 酮 Ⅱ A 对 照 品 适 量，置 于 不 同 体 积 的 量 瓶 中 ，用 甲 醇 配 制 成 母 液 ，各 吸 取 一 定体积，配制 成 分 别 为 38. 4，145. 8，6. 1，3. 42，11. 6 mg·L － 1 的混合对照品溶液，摇匀，4 ℃ 避光保存。 2. 3 供试品溶液制备方法的建立 2. 3. 1 提取溶剂考察 取丹参药 材粉末 （ 过 50 目 筛）0. 3 g，精密称定，置于 100 mL 具塞锥形 瓶 中，分 别精 密 加 入 70% 甲 醇、80% 甲 醇、90% 甲 醇、纯 甲 醇、70% 乙醇、80% 乙 醇、90% 乙 醇 50 mL，称 重，加 热回流 1 h，放冷 后 用 提 取 溶 剂 补 足 质 量，提 取 液 经 0. 45 μm 微孔滤膜滤过，取续 滤 液，以 2. 1 项 下 色 谱 条件进行测定。
［Key words］ Salvia miltiorrhiza Bge. ；rosmarinic acid；salviamolic acid B；clyptotanshinone； tanshinone Ι； tanshinone ⅡA ；high performence liquid chromatography