第十八章 高效液相色谱法

纵向扩散 β=2γDm 可以忽略。
因为Dl很小，室温操作，且U大于U最佳， 传质阻抗：固定相传质阻抗CS可以忽略 ，因df极小 流动相传质阻抗Cm
Cm
mdP2
Dm
要求： dp小，Dm大
静态流动相传质阻抗：
由于部分流动相在固定相微孔内的滞留 静态流动相传质阻抗系数Csm Csm ∝dp2， Csm ∝1/Dm，而Dm∝T/η 要求: 固定相dp2、 流动相η都小 H=A+Cmu+Csmu HPLC的实验条件应该是： ①小粒度、均匀的球形化学键合相；②低粘度流动 相，流速不宜过快；③柱温适当。
5 10 72.1
( P2' 8.7 ) / 2
P2' 8.7 1.16 2
6.38 5.1 (1 ) 10.2
= 0.75
即调整溶剂比例为 75%甲醇和25%水可使该组分的 k 值为5。
四、正相键合相色谱法

固定相：极性键合相
如－CN、－NH2或二羟基键合硅胶
固定相
离子对
通式
+ B +A
( B+ A )m
( B+ A ) s
[B A ]s [B A ]s KB A [B ]m [B ]m [A ]m

m
EBA A

m
影响容量因子的因素
1. 离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析
方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键 合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立 的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米
高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-12g （荧光检测）
例 在一反相色谱柱上，当流动相为30%甲醇和70%水
(体积比)时，某组分的保留时间为25.6min，死时间为
0.35min，如何调节溶剂配比使组分容量因子为5？ 解：初始值
25.6 0.35 k1 72.1 0.35
' P 1 0.30 5.1 0.70 10.2 8.7
使溶质分子与键合相的烃基发
生疏水缔合。不是溶质分子与
键合相间的色散力。
3.保留行为的主要影响因素
（1）溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。 （2）固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。
流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂
适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物 分离机制？ 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用
组分的保留和分离 分离选择性决定于键合相的种类、流动相的
强度和试样的性质
极性强的组分k大，后洗脱出柱。 流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小， tR 减小。反之， k增大，tR增大。

化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合 在载体表面所形成的固定相 。 根据化学键合相与流动相极性的相对强弱 正相和反相键合相色谱法
1.键合反应
硅氧烷（Si－O－Si－C）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应
硅氧碳键型：
≡Si—O—C
化学键合相形成具备的条件 1.载体表面应有某种活性基团
2.固定液应有与载体表面发生化学反应的官能团
流动相为气体，无毒
运行和操作容易
流动相有毒，可供选择范围宽
（梯度洗脱） 运行和操作比GC难一些
特点： 具有分离效率高
选择性好
分析速度快 检测灵敏度高 应用范围广 流动相选择范围宽 柱后流出组分不被破坏，易制备
第一节
高效液相色谱法的主要类型 及其固定相和流动相
一、主要类型
1.固定相的聚集状态 液液色谱法（LLC）和液固色谱法（LSC） 2.分离机制： 分配色谱法 吸附色谱法
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
HPLC仪器结构示意图（方框图）
（1）高压输液泵
恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。 常用柱塞往复泵 双泵：为了克服流量的脉动。 有串联式和并联式 输液泵应具备的性能：
流量精度高且稳定
流量范围宽 能在高压下连续工作 液缸容积小 密封性能好，耐腐蚀
输液泵操作注意事项：
P
' mix
i Pi
i 1
n
'
式中i 为混合溶剂中各溶剂的体积百分数。 二元混合溶剂的则为
P P B P
' AB ' A A
式中A， B分别为二元混合溶剂中溶剂A和溶剂B的体积百分数。
溶剂的选择性
溶剂可分为八组而分别位于图中不同区。 I 组的 xe值较大， 属质子受体溶剂； VII 组的 xd 值较大，属质子给于体溶剂； V 组
①防止固体微粒进入泵体
② 流动相不应含有腐蚀性物质
④不超过规定的最高压力
③防止溶剂瓶内的流动相被用完 ⑤流动相一般应该先脱气
梯度淋洗（洗提、洗脱）
分离过程中按一定程序连续改变载液中溶剂即流动相 的配比和极性以提高分离效果（类似GC中的程序升温） 高压梯度和低压梯度
高压梯度
低压梯度
二、分离和进样系统
）。
A 样品的k降低，tR降低 B 样品的k增加，tR增加 C 相邻组分的增加 D 对基本无影响
2．用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品，以某一比例甲醇一水为 流动相时，样品容量因子较小，若想使容量因子适当增加，较好 的办法是（ ）。 A 增加流动相中甲醇的比例 C 流动相中加人少量HAc B 增加流动相中的水的比例 D 流动相中加人少量的氨水
含碳量：含碳的百分数
覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基 总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯 硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。
4.键合相的特点 使用过程中不流失； 化学稳定性好； 柱效高，分离选择性好；
适于梯度洗脱；
载样量大
注意： 流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解； (也有适用宽pH范围的键合相)
2.键合相的种类 （1）非极性键合相 ：
非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面；
用于反相色谱；ODS （2）极性键合相：
常用-NH2、-CN键合相
（氰乙硅烷基≡Si(CH2)2CN)键合硅胶 一般用于正相色谱
（3）离子交换键合相：
常用-SO3H、 -COOH、 、-R3NCl
3.键合相的性质
一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大
2. 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的 形成），组分的k值最大 3. 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。
第二节
高效液相色谱法分离条件的选择
（一）HPLC中的速率理论 涡流扩散 A=源自文库λdp 球形、小粒度、均匀（RSD＜5%）固定相， 匀浆高压填充，以降低A。
二、分离条件的选择 （一）正相键合相色谱法的分离条件
固定相：极性键合相 如氰基、氨基键合相等
流动相：烷烃加适量极性调节剂
（二）反相键合相色谱法的分离条件 固定相：非极性键合相如ODS 流动相：以水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂 弱酸、弱碱或缓冲盐作为离子抑制剂 加入0.1%∽1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的 作用
离子抑制色谱法（ISC ） 用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH， 抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用， 使k变大。 适用于3≤pKa≤7的弱酸、7≤pKa≤8的弱碱
弱酸，降低流动相pH，k增大， tR增大 弱减，提高流动相pH，k增大，tR增大
六、反相离子对色谱法（PIC）
把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流
4. 不同种类高效液相色谱分离的原理上的差异
三、教学目标
1. 了解高效液相色谱仪的组成
2. 熟练掌握高效液相色谱中的反相和正相色谱的分离原理和
实验条件 3. 掌握化学键合相固定相和流动相及其选择
4. 速率理论方程式在高效液相色谱法的应用
5. 掌握高效液相色谱分离分析中的定性和定量方法
第十八章 高效液相色谱分析法（ HPLC）
经典液相色谱法与高效液相色谱法的比较
经典液相色谱法 常压或减压
高效液相色谱法 高压，40～50MPa
填料颗粒大
柱效低 分析速度慢
填料颗粒小，2～50μm
柱效高,40000～60000块/m 分析速度快
色谱柱只用一次
不能在线检测
色谱柱可重复多次使用
能在线检测
气相色谱与高效液相色谱的比较 气相色谱 不能用于热不稳定性物质的分析 高温（程序升温） 有很灵敏的检测器如ECD和较灵敏 的通用检测器（FID和TCD） 高效液相色谱 可以用于热不稳定物质的分析 室温 没有较高灵敏的通用检测器①
五、反相键合相色谱法
1. 固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶
流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等
应用：非极性至中等极性的组分，还有有机酸、碱及盐等
2. 保留机制：疏溶剂理论
溶质的保留主要是溶质分子与
极性溶剂分子间的排斥力，促
进样器
进样阀（六通阀）、 自动进样装置
色谱柱
分析柱、制备柱
性能评价 ：H、n、fs、k和α的重复性，或R。
柱效评价
1.硅胶柱：样品：苯、萘、联苯及菲（己烷配制） 流动相：无水己烷 2. 反相色谱柱：样品：尿嘧啶、硝基苯、萘及芴
第十八章 高效液相色谱分析法( HPLC)
一、教学内容
1. 高效液相色谱的类型
2. 固定相和流动相及其选择 3. 高效液相色谱仪的组成和各部件的作用
4. 定性和定量分析方法
二、重点与难点
1. 高效液相色谱与气相色谱的异同点 2. 高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用 3. 固定相和流动相的选择
的xn值较大，属偶极作用力溶剂。同组溶剂在分离中具有相似的 选择性，不同组差别较大。
溶剂的选择性
多元混合溶剂的溶剂极性参数计算
对于正相色谱，二元溶剂的极性参数P' 和组分的k值存在如下 关系：
k2 ( P2' P1' ) / 2 10 k1
式中分别为初始和调节后二元溶剂的极性参数。k1、 k2为组分 相应的容量因子。
n α -1 k2 R 4 α 1 k2
（二）流动相的强度和选择性
1. 溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2. 溶剂的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
多元混合溶剂的溶剂极性参数计算
动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离 子对，增加溶质与非极性固定相的作用，使k增加，改善 分离效果。 用于分离可离子化和离子型的化合物
离子对模型
流动相
B + H+ RSO 3 Na BH + + RSO3 + Na+ ( BH+ RSO3 )m ( BH+ RSO 3 ) s
硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。
（3）流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大
中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱碱k变小。
1．在正相色谱中，若适当增大流动相极性则（
（三）反相离子对色谱法的分离条件
固定相 尽可能选择表面覆盖度高且疏水性强的非极性键合相 离子对试剂 离子对试剂所带的电荷应与试样离子的电荷相反 流动相pH 使试样组分与离子对试剂全部离子化
有机溶剂及其浓度 同一般HPLC
第三节 高效液相色谱仪
流程
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC） 3.其他色谱类型 亲合色谱法（AC）
手性色谱法（CC）
胶束色谱法（MC） 化学键合相色谱法
电色谱法（EC）
二、固定相
固定相应符合下列要求：
颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；
化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。
(一)化学键合相色谱法（键合相色谱法） 化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的色谱法。
三、高效液相色谱法的流动相
对流动相的要求： 1. 与固定相不发生化学反应。
2. 对试样有适宜的溶解度。使k在1~10范围内，
3. 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小 于检测波长的溶剂。 4. 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇﹑乙腈等可以降低 柱压，提高柱效。
（一）流动相对分离的影响