黄颡鱼溶酪巨型球菌的鉴定与药敏试验

无菌操作剖解黄 颡 鱼 心 脏、肝 脏、脾 脏 等 组 织， 用接种环于营 养 琼 脂 琼 脂 平 板 划 菌，３７ ℃ 培 养 ２４ ｈ，挑 取 单 个 优 势 菌 落 于 营 养 琼 脂 培 养 基 进 行 纯 化 。 １．２．２ 生 理 生 化 检 测
将纯化后 的 菌 株 分 别 接 种 到 细 菌 生 化 鉴 定 管 中，进行生理生化的 测 定，并 按 照《伯 杰 细 菌 鉴 定 手 册》［１０］和《常 见 细 菌 系 统 鉴 定 手 册 》［１１］使 用 说 明 测 定所菌株的有关生理生化指标。 １．２．３ 细菌 ＤＮＡ 提取
２０
２
０
死 亡 数／尾 １２ １５ ２０ ０
死 亡 率／％ ６０ ７５ １００ ０
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水 产 科 学
第 ３４ 卷
图１ 菌株 ＨＳ１ １６ＳｒＤＮＡ 扩增结果 １：菌株 ＨＳ１； Ｍ：ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ２０００ｂｐ．
２．４ 动 物 感 染 试 验 分别注射密 度 为 ３．０×１０８个／ｍＬ 的 菌 悬 液 ２、
性超过９９％，进化树上与溶酪巨型球菌聚为一支，从而可判定 ＨＳ１为溶酪巨型球菌。用溶酪巨 型 球 菌
ＨＳ１感染健康黄颡鱼，发现该菌具有较强的致病性。药敏试验表明，该菌对四环素、米诺环素和 强 力 霉
素等１１种药物敏感，对复方新诺明、甲氧苄啶和氨磺甲基异恶唑３种药物耐 药。 这 为 黄 颡 鱼 巨 型 球 菌
第 ３４ 卷 第 １２ 期 ２０１５ 年 １２ 月
水产科学
ＦＩＳＨＥＲＩＥＳ ＳＣＩＥＮＣＥ
ＤＯＩ：１０．１６３７８／ｊ．ｃｎｋｉ．１００３－１１１１．２０１５．１２．００８
Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．１２ Ｄｅｃ．２０１５
黄颡鱼溶酪巨型球菌的鉴定与药敏试验
蓝胜华，王 利，邓麟杰，杨启明，李雪峰，段荟芹
（西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 ６１００４１）
２ 结 果 和 分 析
２．１ 菌 株 分 离 在营养琼脂培养基培养 １７ｈ，可 见 单 个 菌 落 稍
隆起，圆形和全圆，表 面 闪 光 至 稍 粗 糙，黏 韧 至 奶 油 状。经革兰氏染色 观 ［１４］ 察该菌 为 革 兰 氏 阴 性 菌，成 对或 双 球 排 列 成 链，偶 尔 有 ８～１０ 个 双 球 菌 排 列 成链。 ２．２ 生 理 生 化 分 析
该菌表现为革兰氏 阴 性 菌，乳 酸 盐、葡 萄 糖、果 糖产气，甘 油、麦 芽 糖、甘 露 醇、山 梨 醇 和 蔗 糖 中 生 长，阿拉伯 糖、纤 维 二 糖、糊 精、七 叶 灵、半 乳 糖、菊 糖、乳糖、甘露糖、棉籽 糖、鼠 李 糖、水 杨 苷、淀 粉、海 藻糖、木 糖 中 不 生 长，产 生 Ｈ２Ｓ。 参 照《伯 杰 细 菌 鉴 定手册 》［１０］可 初 步 确 定 分 离 菌 为 溶 酪 巨 型 球 菌 （Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｒｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）。 ２．３ １６ＳｒＤＮＡ 基因扩增
Ｓ０７１００７）． 作者简介：蓝胜华（１９９３－），男，本科在读；研究方向：微 生 物 遗 传 学．Ｅ－ｍａｉｌ：４７８４１３８７３＠ｑｑ．ｃｏｍ．通 讯 作 者：王 利 （１９７７－ ），女，
副 教 授 ，博 士 ；研 究 方 向 ：水 生 动 物 疾 病 学 ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｎｘｉｎ９１６＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ．
表 １ 分 离 菌 生 化 试 验 结 果
试验项目
结果
试验项目
乳酸盐 葡萄糖
果糖 甘油 麦芽糖 甘露醇 山梨醇 蔗糖 乳糖 水杨苷 海藻糖 木糖
（＋） （＋） （＋）
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － －
阿拉伯糖 纤维二糖
糊精 半乳糖
菊糖 甘露糖 棉籽糖 七叶灵 鼠李糖
淀粉 Ｈ２Ｓ
注 ：（＋ ）表 示 产 气 ，＋ 表 示 阳 性 ，－ 表 示wenku.baidu.com阴 性 ．
３、４ ｍＬ 到 健 康 的 黄 颡 鱼 体 内，均 能 导 致 黄 颡 鱼 患 病，４ｍＬ 试验组第３ｄ开始 死 亡，２ ｍＬ 试 验 组 和 ３ ｍＬ 试验组第 ４ｄ 开 始 出 现 死 亡；其 主 要 症 状 表 现 为眼球突出，体表 有 大 小 不 一 的 烂 斑，鳍、胸、腹、尾 均可见局灶性出血。 鱼 嘴、鱼 须 溃 烂，肛 门 红 肿，而 注射生理 盐 水 的 对 照 组 则 无 明 显 症 状。 人 工 回 复 感染后黄颡鱼的发 病 症 状 与 自 然 发 病 基 本 一 致，并 自发病鱼体再次分 离 到 细 菌，经 鉴 定 确 认 黄 颡 鱼 的 发病是由溶酪巨型球菌引起。 ２．５ 药 敏 试 验
采用 ＤＮＡ 水煮 法 对 纯 化 菌 落 进 行 ＤＮＡ 的 提 取，具体过 程 为：挑 取 二 次 纯 化 后 的 单 个 菌 落 于 １ ｍＬ ｄｄＨ２Ｏ 的 ＥＰ 管中，放入 －８０ ℃ 的 冰 箱 中 冷 冻 约５０ｍｉｎ，然后将冰冻过的细菌置于 １００ ℃ 的沸水
收 稿 日 期 ：２０１５－０１－２１； 修 回 日 期 ：２０１５－０５－２５． 基金项目：四川省科技支撑项目（２０１３ＦＺ００１４）；国家级卓 越 农 林 工 程 师 项 目；西 南 民 族 大 学 研 究 生 学 位 点 建 设 项 目 （２０１５ＸＷＤ－
第 １２ 期
蓝 胜 华 等 ：黄 颡 鱼 溶 酪 巨 型 球 菌 的 鉴 定 与 药 敏 试 验
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中煮沸约２５ｍｉｎ后，１２０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ，提 取 上清液即为 ＤＮＡ 模版。 １．２．４ １６ＳｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增与分析
采 用 １６Ｓ ｒＤＮＡ 通 用 引 物，上 游 引 物 为 ５ ‘ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｔａｇ－３’，下 游 引 物 为 ５‘ａｃｇｇｃｔａｃ－ ｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ－３’，引物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司合 成。ＰＣＲ 反 应 体 系：ｄｄＨ２Ｏ １９μＬ、Ｔａｑ Ｍｉｘ ２５μＬ、引 物 １６ｓ－Ｆ １μＬ、１６－Ｒ １μＬ、ＤＮＡ ４μＬ，反 应 总 体 积 ５０μＬ。 混 匀 后 放 入 离 心 机 中 ４０００ｒ／ ｍｉｎ，离心１５ｓ。 放 入 ＰＣＲ 仪 中 进 行 扩 增，ＰＣＲ 反 应 条件：９４ ℃预变性４ｍｉｎ；９４ ℃变性３０ｓ，６０ ℃退 火３０ｓ，７２ ℃ 延 伸 ４ ｍｉｎ，５ 个 循 环；９４ ℃ ３０ｓ， ５０ ℃ ３０ｓ，７２ ℃ ４ｍｉｎ，３０个循环。ＰＣＲ 反应结束 后，取５μＬ 产物 进 行 １％ 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测， 所 用 电 压 为１００Ｖ，电 泳３０ ｍｉｎ，之 后 用 凝 胶 成 像 系 统进行拍照。将阳性产物送至成都擎科梓煕公司 进行测序 分 析。 所 得 程 序 采 用 Ｂｌａｓｔｎ 程 序 进 行 同 源性 检 索，采 用 ＣｌｕｓｓｔａｌＸ 软 件 进 行 多 序 列 全 局 对 比，利用 Ｍｅｇａ５．０ 软 件，选 用 邻 接 法，自 举 １０００ 次 构建系统发育树 。 ［１１］
以粗提 ＤＮＡ 模板进行 ＰＣＲ 扩 增，取 其 产 物 进 行电泳 检 测，可 见 条 带 单 一 （图 １）。 菌 株 ＨＳ１ 的 １６ＳｒＤＮＡ 序 列 为 １４６６ｂｐ。 将 序 列 提 交 到 Ｇｅｎ－ Ｂａｎｋ，获得收录号为 ＫＰ１９１０４６。 将 序 列 进 行 Ｂｌａｓｔ 比对分析发现，ＨＳ１的１６ＳｒＤＮＡ 序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 数据 库 公 布 的 溶 酪 巨 型 球 菌 ＮＲ＿０７４９４１ 的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 基 因 序 列 同 源 性 高 达 ９９％。 同 时 运 用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ２．０，ＭＥＧＡ５．０ 将 ＨＳ１ 的 基 因 序 列 选 取 运 用 ，构 建 系 统 发 育 树 （图 ２）。
采用标准 Ｋｒｉｂｙ－Ｂａｕｅｒ纸片扩散法进行药 敏 试 验，置于３７ ℃ 培养箱中培养 ２４ｈ，量取抑菌圈的直 径。测定标准 参 照 美 国 临 床 实 验 室 标 准 化 协 会［１３］ 标准。采用 的 抗 生 素 有 四 环 素、米 诺 环 素、强 力 霉 素、诺氟沙星、氧氟 沙 星、氟 苯 尼 考、氨 苄 西 林、链 霉 素、恩诺沙星、庆大 霉 素、卡 那 霉 素、复 方 新 诺 明、甲 氧 苄 啶 、氨 磺 甲 基 异 恶 唑 。
１．２．５ 动 物 回 感 试 验 取３０ ℃培养２４ｈ 的 分 离 菌 培 养 物，制 成 菌 悬
液，并参照麦式比浊 管 的 对 比 方 法 将 菌 悬 液 的 细 菌 密 度 调 至 ３×１０８ 个／ｍＬ。 同 时 将 体 质 量 约 ４５０ｇ 的 试验鱼分为４ 组，分别标记为第 Ⅰ 组、第 Ⅱ 组、第 Ⅲ 组、第Ⅳ 组，每 组 ２０ 尾，第 Ⅰ ～ Ⅲ 组 分 别 腹 腔 注 射 剂量为２、３、４ｍＬ 的菌悬液，对照组注射２ｍＬ 生理 盐水。将以 上 试 验 组 分 别 置 于 ２ ｍ×２ ｍ 的 鱼 缸 中 ，水 深 ７０ｃｍ，连 续 充 氧 ，观 察 １ 周 。 １．２．６ 药 敏 试 验
结果
－ － － － － － － － － － ＋
组别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
菌 密 度／个 ·ｍＬ－１ ３．０×１０８ ３．０×１０８ ３．０×１０８ 生理盐水
表 ２ 黄 颡 鱼 腹 腔 注 射 试 验 结 果
数 量／尾
注 射 计 量／ｍＬ
发 病 数／尾
２０
２
１８
２０
３
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２０
４
２０
摘 要：自患病黄颡鱼中分离出一株优势菌 ＨＳ１，根 据 细 菌 形 态 学 观 察、生 理 生 化、１６ＳｒＤＮＡ 基 因 序
列分析、动物回感试验及药敏试验等 方 法 对 其 菌 株 进 行 研 究。 试 验 结 果 表 明，菌 株 ＨＳ１ 为 动 力 阳 性，
革兰氏阴性球菌。扩增的１６ＳｒＤＮＡ 序列大小 为 １４６６ｂｐ，登 录 号 为 ＫＰ１９１０４６，与 溶 酪 巨 型 球 菌 同 源
病的预防和治疗提供科学参考。
关 键 词 ：黄 颡 鱼 ；溶 酪 巨 型 球 菌 ；分 离 鉴 定 ；药 敏 试 验
中 图 分 类 号 ：Ｓ９１７
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００３－１１１１（２０１５）１２－０７７８－０５
黄 颡 鱼 （Ｐｅｌｔｅｏｂａｇｔｕｓ ｆｕｌｖｉｄｒａｃｏ）又 名 黄 腊 丁、嘎 鱼，广 泛 分 布 在 我 国 各 大 干 支 流 及 附 属 水 体 中，在江河、湖 泊、池 塘 中 均 有 栖 息，是 目 前 经 济 价 值较高的鱼类品种之一。黄颡鱼不仅能促进人体 吸收铁、锌、硒等人体 所 需 的 矿 物 元 素，对 儿 童 的 生 长发育 和 中 老 年 的 抗 衰 老 也 具 有 积 极 作 用 。 ［１］ 因 此，得到广 大 消 费 者 的 青 睐，市 场 需 求 旺 盛。 近 年 来，随着集约化养殖 规 模 的 扩 大，病 原 微 生 物 传 播、 化学品滥用及其水 体 富 营 养 化 现 象 日 益 严 重，黄 颡 鱼细菌性疾病不断 涌 现，给 黄 颡 鱼 的 养 殖 造 成 了 巨 大的经济损失。目前已报道的黄颡鱼细菌性病原 有嗜水气 单 胞 菌 （Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、点 状 气 单 胞 菌 （Ａ．ｐｕｎｃｔａｔａ）、温 和 气 单 胞 菌 （Ａ．ｓｏｂｒｉａ）、维 氏气 单 胞 菌 （Ａ．ｖｅｉｏｎｉｉ）、迟 钝 爱 德 华 氏 菌 （Ｅｄ－ ｗａｒｄｓｉｅｌｌａ ｔａｒｄａ）、鲇 鱼 爱 德 华 氏 菌 （Ｅ．ｉｃｔａｒｄａ）、
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 患病黄颡鱼６ 尾，体 长 约 １３ｃｍ，体 质 量 约 ４５０
ｇ，鳃 部 及 鳍 部 明 显 充 血，肛 门 红 肿，体 表 黏 液 重 且 有烂斑。营养 琼 脂 培 养 基、生 化 鉴 定 管、药 敏 纸 片 购 自 杭 州 生 物 试 剂 有 限 公 司。 ＴａｑＭｉｘ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ 购 自 北 京 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司 。 １．２ 方 法 １．２．１ 细 菌 分 离
爱德华 氏 菌 （Ｅ．ｂａｃｔｅｒｉａ）和 小 肠 结 肠 炎 叶 尔 森 氏 菌 （Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）等 ［２－９］。本 研 究 自 患 病 黄颡鱼体内分离到菌株 ＨＳ１，并对 其 进 行 形 态 学 观 察、生理生化试验、１６ＳｒＤＮＡ 基因分析及构建系统 发育树进行 鉴 定，同 时 采 用 Ｋｒｉｂｙ－Ｂａｕｅｒ纸 片 扩 散 法对菌株 ＨＳ１进行耐药性分析，以期为黄颡鱼细菌 病害的防治提供参考。