大肠杆菌抗药性菌株的筛选

大肠杆菌抗药性菌株的筛选

【实验目的】

掌握微生物变异的原理，学习用梯度平板法分离抗药性突变株。【实验原理】

基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理、化学、生物因素对微生物都有诱变作用。

基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异。这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。抗药性突变株是指野生型菌株基因突变产生的对某些化学药物的抗性变异类型，可在加有相应药物的培养基平板上选出。抗药性突变是DNA 分子的某一特定位置的结构改变所致，有药物的存在无关，药物的存在只是作为分离某种抗药性菌株的鉴别手段。在含有一定浓度抑制生长的药物平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞在平板上长成菌落。纯化后进一步进行抗性试验，就可以得到所需的抗药性菌株。

为了便于选择适当的药物浓度，分离抗药性突变株常用梯度平板法。本实验用梯度平板法分离大肠杆菌抗链霉素、青霉素和红霉素突变株。

【实验器材】

大肠杆菌 ; LB液体培养基； LB琼脂培养基；链霉素、青霉素和红霉素；70%乙醇；无菌吸管，烧杯，试管，玻璃涂棒，水浴锅等。

【操作步骤】

1.接种大肠杆菌与盛有5ml L B培养液的试管中，37℃震荡培养24h。

2.在水浴锅中融化LB培养基。

3.倒10ml已融化不含药物的LB琼脂培养基于无菌培养皿中，将培养皿一端垫起使培养皿表面在垫起的一端刚到培养皿的底与边的交界处凝固。

4.在凝固的平板底部高琼脂一边标上低，放平后在底层培养基上分别加入每毫升含有100ug链霉素、青霉素和红霉素的LB琼脂培养基10ml，凝固后制得链霉素浓度从0到另一端的100ug∕ml 的梯度平板。

5.用1ml无菌吸管吸取0.2ml大肠杆菌培养液加到梯度平板上。用无菌玻璃涂棒将菌液均匀涂布到整个平板表面。如用蘸有乙醇

并经火焰灭菌的玻璃涂棒，可在火焰旁或伸进培养皿在板盖上充分冷却以免烫死细胞。

6.将平板于37℃培养48 h.

7.选择1—2个生长在梯度平板中部的单个菌落，用无菌接种环接触该菌落朝高药物浓度的方向划线。

8.将平板倒置于37℃培养48 h。

【注意事项】

1.玻璃涂布棒在火焰上灼烧后要待其冷却后再进行涂布，以免烫死细胞；可以蘸上乙醇后在火焰上灼烧，以缩短冷却的时间。

2.制备含药平板时，务必使药物与培养基充分混匀。

3.严格无菌操作，勿将杂菌误为抗药性大肠杆菌。

注：

LB(Luria-Bertani)培养基

蛋白胨 10克酵母膏 5克

NaCl 10克蒸馏水 1000ml

PH 7.0

121℃灭菌20min.