基因工程复习重点

基因工程复习指南

第一章．基因工程定义

第二章琼脂糖凝胶电泳制备

．琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶的差别？琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的标准方法。琼脂糖凝胶分离片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的片段；

聚丙烯酰胺凝胶电泳主要分离小片段DNA(5-500bp),其分辨力极高，甚至可分开相差1bp的片段。实验室中一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行电泳。

EB的作用溴化乙啶，它可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光，检测DNA的下限可达1-10ng<。注意：EB是强诱变剂！EB的染色方式：直接加入胶中；加入上样混合液中；不加，跑完胶后，用EB溶液染色。第三章质粒的提取、分离和纯化．

载体的概念( vector)

把一个有用的目的片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体

．载体的类型：质粒（plasmid）、l噬菌体（phage）、Cosmid等，其中细菌质粒是重组DNA技术中最常见的载体。

质粒的不相容性（incompatibility）利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为质粒的不相容性。但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在

质粒的三种形式

质粒分子呈双链共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型(closed circle DNA，ccDNA)，有时会因单链断裂而成为开链环状DNA(open circle DNA，ocDNA)有时双链断开成线性DNA(Liner DNA，LDNA)。

载体的报告基因(标记基因)

基因工程中利用载体上特地引入的一些具有特殊标志意义的基因，可用来证明载体已经进入宿主细胞，并可用来将含有目的基因的宿主细胞从其他细胞中识别区分甚至挑选出来。这种具有标志意义的基因称为报告基因(reporter gene)，或标记基因。报告基因通常是处于另一基因下游，

并可反映转录及上游基因表达水平的基因。

质粒载体的基本特性和要求：

分子量小、多拷贝、松弛控制型

具有多种常用的限制性内切酶的单切点。

能插入较大的外源片段

具有容易操作的检测表型。

质粒的制备基本原理：

从细胞中分离质粒的方法都包括个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒

第四章

限制性内切酶

一类以环状或线形双链为底物，能识别中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3`-OH和5`-P基团DNA 片段的内脱氧核苷酸酶

几乎所有种类的原核生物都能产生限制酶，根据结构和功能特性，可将限制酶分为I、II、III型。I型和III型限制酶的切点不固定，不能产生可以利用的DNA片段，只有II型限制酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段，因此基因工程中所用的限制酶部是II型限制酶。

限制性内切酶的定义、命名

1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指型限制酶。

2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。

异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）

1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶

2.特点：1）识别相同顺序

2) 切割位点的异同

KpnI GGTAC C Asp718 GGTACC

SstI CCGC GG SacI CCGC GG

．内含子鉴定的四种方法

常用的两种反转录酶

1. AMV反转录酶

结构与酶活性反转录酶以α，αβ，ββ形式存在，其中β（无活性）→P32（内切酶活性）α→聚合酶+ P24（RNase H活性），各步反应由蛋白酶催

化）聚合酶活性

a. RNA，DNA引物（大于8 nt）→cDNA链

DNA-RNA引物→互补DNA链

(rA)1100 (dT)12-18→(dT)n or (rc)n..dG n→(dG) n

反转录酶

1)特点：

不具内切酶活性; RNase H活性低;稳定性差

2)与AMV反转录酶比较

a．合成短链cDNA(0.6 kb)时，两者相同，但M- MLV反转录酶需要量大，可能与其稳定性差有关

b.合成长链时，它比AMV反转录酶有效得多，这与它无内切酶活性有关。

3)用途

a. cDNA合成用于文库建立

b. 制备cDNA探针

c. DNA序列分析

d. 填补突起末端以获平端。

第五章

1．如果一个载体有两个或两个以上的复制起点，那么这个载体会有什么不一样？

有两种情况：一是两个复制起点适用的宿主细胞不一样，比如说，一个复制起点适合于大肠杆菌，因为大肠杆菌是基因工程中使用频率最高的宿主菌，另一个复制起点适合于另一种细菌或真核生物细胞，那么这种克隆载体常称之为穿梭载体（shuttle vector），换言之，穿梭载体可在两种生物内进行来回的穿梭；

另一种情况是同一个载体中的两个复制起点都是适合于一种细胞的，只不过这两个复制起点分别是在一定遗传背景条件下起作用，这种类型的载体多数是属于大肠杆菌的载体。

2．多克隆位点区：分子克隆载体的目的就是要将外源基因通过体外重组，形成重组DNA分子，然后再转移到某种宿主细胞内，那么克隆载体就应该有一个位点供外源DNA插入，这个位点就是克隆位点。克隆位点一定是一个限制酶切位点，而且必须是由6个核苷酸或6个核苷酸以上的序列组成的限制酶识别位点。虽然克隆位点是限制酶识别位点，但不是