蛋白质定向进化技术

蛋白质定向进化技术
DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 个来源于大肠杆菌的 E b g A蛋白， 这个酶几乎 A蛋白， 不具备 β-半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一 碳源的平板上筛选 L a c- 缺失的大肠菌株 ，野生 c型的 E b g A就进化成为了具有 β- 半乳糖苷酶活 A就进化成为了具有 性的酶。
蛋白质定向进化技术 （DE technology of Protein）
108032008105--108032008120 108032008105--108032008120
蛋白质定向进化技术
★定义（definition） 定义（definition） ★原理（theory） 原理（theory） ★显著特征（marked features） 显著特征（mar法（methods） ★筛选方法（screening technique） 选方法（ technique） ★应用及展望（application and prospects） 应用及展望（application prospects）
蛋白质定向进化技术
频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；太低 ， 野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于 每一 D N A序列来说，合理的碱基突变数是 1-3 。 A序列来说，合理的碱基突变数是 理想的碱基置换率和易错P R的最佳条件则依赖 理想的碱基置换率和易错P C R的最佳条件则依赖 于随机突变的目标 D N A片段的长度。 A片段的长度。
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当 D N A s h u f f l i n g用来重组一套进化上相 g用来重组一套进化上相 关的基因时 ，又被称为 f ami l y s h u f f l i n g 。 N I 等用 family shuffling对同源性为 7 8 . 5 ％ shuffling对同源性为 -9 6 ％ 4种白蚁的 3 O--3 O 倍。
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蛋白质定向进化技术
实例
科学家FORTIN等运用易错 PCR、饱和突变和 科学家FORTIN等运用易错 PCR、饱和突变和 DNA s h u -f f l i n g对加双氧酶 ( D o x G ) 进行定向进化，得到 D g对加双氧酶 o x G的变异体 D o x G sma2 ，其专一性常数明显提高。 G的变异体 比野生型加双氧酶提高了 7 7 0 倍。
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Eddie等运用 Eddie等运用 DNA 重组和 St EP技术使大肠杆菌 EP技术使大肠杆菌 B2 葡糖苷酸酶的活力提高了 200倍. 并且具有高 200倍 频率、 高密度的交叉水平. 高密度的交叉水平.
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●过渡模板随机嵌合生长
过渡模板随机嵌合生长 ( random chimeragenesis on transient templates ，RACHITT ) 技术是与 D N A 重组概念上明显不同的、改进的基因家族 重组技术。
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成功范例 （1）Shao等利用此方法成功地对枯草杆菌蛋白酶 E进
行 DE得到突变酶, 其热稳定性提高了8倍. DE得到突变酶, 其热稳定性提高了8
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（2） Fukuda等用此法通过对mRNA展示方法取得 Fukuda等用此法通过对mRNA展示方法取得 的编码基因的碱基通过嘌呤突变, 的编码基因的碱基通过嘌呤突变, 然后进行类似于 DNA 重组的全长基因装配,对单链抗体进行针对性 重组的全长基因装配, 地体外进化, 地体外进化, 对抗库经过 4轮挑选, 获得了 6个不 轮挑选, 同序列的编码基因, 动力学分析显示, 同序列的编码基因, 动力学分析显示, 突变的 scFvs的亲和力提高大约 30倍 scFvs的亲和力提高大约 30倍.
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其他方法
随机插入-删除链交换突变、基于Y 随机插入-删除链交换突变、基于Y连接的构件改 组、随机引物体外重组、临时模板随机嵌合生长、 设计的寡核苷酸装配、非同源随机重组、用于产 生杂合酶的递增截短等。
二、刷选
蛋白定向进化最核心的部分在于建库的多样性和 蛋白定向进化最核心的部分在于建库的多样性和 筛选的高效性。 筛选的高效性。 筛选过程首先是将突变基因进行分离并尽可能多 地表达成蛋白质 ，其次是将蛋白质的活性通过亲 和、催化或报告基因等方式表现为可检测的形式， 最后是将符合要求的蛋白质分离出来。
蛋因进行突变、重组、表达和 DE的原理是对目的基因进行突变、重组、表达和 筛选,在试管内模拟蛋白质的自然进化过程, 筛选,在试管内模拟蛋白质的自然进化过程, 获取 人们需要的、具有特定性质和功能的蛋白质。
蛋白质定向进化技术
3个显著特征：
(1) 进化的每一关键步骤都受到严密控制。 (2) 除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入 一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反 应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径。 (3) 能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特 征。
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特点 ( 1 ) RPR可以利用单链 DNA或 m RNA为模板，故可1 ORPR可以利用单链 DNA或 RNA为模板，故可1 O2 0倍地降低亲本 DNA量 ； ( 2 ) 在 D N A改组中，片段 0倍地降低亲本 DNA量 A改组中，片段 重新组装前必须彻底除去 D N a s e I ，故 R P R方法更简 R方法更简 单 ；( 3 ) 合成的随机引物具有同样长度 ，无顺序倾向性。 在理论上， PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相 PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相 似的频率发生突变；( )随机引发的 DNA合成不受 似的频率发生突变；( 4 )随机引发的 DNA合成不受 DNA 模板长度的限制 。这给小肽的改造提供了机会。
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在通常情况下， 经一轮的易错 P C R、 定向筛选， R、 很难获得令人满意的结果，由此发展出了连续易 很难获得令人满意的结果，由此发展出了连续易 错 P C R，该方法是将一次 P C R扩增得到的有益 R，该方法是将一次 R扩增得到的有益 突变基因作为下一次 P C R扩增的模板，连续反 R扩增的模板，连续反 复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累 积而产生重要的有益突变。
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它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是 将随机切割的基因片段杂交到一个临时 D N A模 A模 板上进行排序、修剪、空隙填补和连接。其中的 悬垂切割步骤使短片段 ( 比 D Nase消化片段还短) Nase消化片段还短) 得以重组，明显提高了重组频率；如果在片段重 组前后采用错误倾向 P C R 还可引入额外点突变。
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DE属于蛋白质的非理性没汁, 它不用事先了解蛋 DE属于蛋白质的非理性没汁, 白质的结构、保守位点、催化机制等, 白质的结构、保守位点、催化机制等, 具有相当大 的应用价值。 这项技术综合了分子生物学的方法和高通量的 刷选技术从而使其更具优势 ，可以简化试验过程 ， 并且能够筛选出即便只有小幅提高目的性状的突 变体. 变体.
■易错 PCR ■ DNA改组 DNA改组 ■体外随机引发重组 ■过渡模板随机嵌合生长 ■交错延伸
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●易错 P C R
易错 P C R是指通过改变 P C R的反应 条件，如： R是指通过改变 R的反应 调整反应体系中4 调整反应体系中4种 d NTP的浓度、增加Mg 2+ 的 NTP的浓度、增加Mg 浓度、加入 Mn 2 + 或使用低保真度T a q酶等，使 或使用低保真度T q酶等，使 碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构 建突变库，刷出所需的突变体。易错 P C R的关 R的关 键是控制D A的突变频率 键是控制D N A的突变频率。
筛选
筛选方法选取以下标准：首先对目的蛋白要具有 针对性 ，即所筛即所得，这也被称为进化第一定 律。其次，必须是高通量的刷选方法。最后 ，检 测方法必须可行 ，检测过程必须灵敏 。 总的来说 ，刷选没有一个通用的法则，方法 要根据所需蛋白的特性所决定。
筛选
常用的筛选方法有：利用底物显色反应，改变培养条件 ( 如逐步提高培养温度，或改变培养基的 p H 等) ，利用 某些蛋白的固有性质，如产生绿色荧光 ，或高通量筛选 (HTS ) ，该技术可以根据待测样品的合成路线分为液相 和固相筛选，也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合 性筛选、酶活性刷选、细胞活性筛选等。
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●D N A改 组 A改
D N A 改组 ( D N A s h u f f l i n g )又称有性 P )又称有性 C R ，是将一群密切相关的序列 ( 机酶切成小片段，这些小片段之间有 部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导 P C R 延伸，并重新组装成全长的基因 。
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●交错延伸 (S t E P )
一种简化的 D N A 重组方法，它不是由短片段组装全长 基因，而是在 PCR反应中，将含不同点突变的模板混合， PCR反应中，将含不同点突变的模板混合， 随之进行多轮变性、短暂复性及延伸反应，在每一轮中， 那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板 上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，如 此重复直至获得全长基因片段。
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●体外随机引发重组
体外随机引发重组 (RPR) 是用一套随机序列引物， 产生互补于模板不同位置的短 DNA片段库 ( 由于 DNA片段库 碱基错配， 这些短 DNA片段也含有少量的点突 DNA片段也含有少量的点突 变) 。然后进行类似于DNA shuffling的全长基因 。然后进行类似于DNA shuff界：蛋白质→进化→ 自然界：蛋白质→进化→特定的生物学功能 机体外复杂的化学体系中 一些 特征№人 们期望 ， 特征№ 如产物抑制 。获得具有新的功能和特性的蛋白质： 一是 从大量未知的自然种系中寻找 ； 二是改现有已知的天然 蛋白质或酶。 对于在自然进化过中没有经过选择的特性来说， 后一 条途径可能更合适 。→产生发展
筛选
具体的筛选方法：琼脂板涂布法、微孔板悬浮法
、
流式细胞计数法 、展示技术
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●琼脂板涂布法 琼脂平板法是一种传统的筛选方法，利用 营养缺陷型或添加抗生素的培养基、高温、 酸碱性环境等特殊条件培养突变菌。通过 宿主菌的生长与不生长、培养基颜色变化、 特定反应的出现等，判断是否具有目的基 因。
蛋白质定向进化技术
定义
定向进化技术是一种在生物体体外 ( 试管 中) 模拟达尔文进化 ，利用自然选择的动 力进化出在自然界并不存在的或是具有更 优性质的蛋白。
蛋白质定向进化技术
定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策略。 主要是在实验室里模拟自然进化过程，通过由易 错 P C R、致突变茵株诱变等方法对编码蛋白质 R、致突变茵株诱变等方法对编码蛋白质 的基因进行随机诱变，由 D N A改组、随机引导 A改组、随机引导 重组和交错延伸等方法进行突变基因体外重组， 设计高通量筛选方法来选出需要的突变株。它不 仅可快速产生工业上有用的新酶， 而且对研究蛋 白质的结构与功能的关系具有非常重要的意义 。
蛋白质定向进化技术
基本步骤 第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起 始创建分子多样那些编码改进功能产物的基因被 利用来继续下一轮进化; 利用来继续下一轮进化;重复这个过程直到达到目 标。
一、体外定向进化的方法