第五章 种子生活力与活力测定
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2、四唑染色测定原理 有生活力的种子活细胞在呼吸过程中都会发生氧化 还原反应。四唑溶液（无色）被种子活组织吸收后， 参与活细胞的还原反应，从脱氢酶接受氢离子，被还 原成红色、稳定、不扩散、不溶于水的三苯基甲臜；
DPNH2 + TTC → DPN + TTCH + HCl
(辅酶IH2) (四唑) (辅酶I) (甲臜) (氯化氢)
ISTA Working Sheets on Tetrazolium Testing, Volume I, 1st Edition, 2003 Volume I - Agricultural, Vegetable and Horticultural Species By N. Leist and S. Krämer Illustrated by J. Pfäfflin
Gansu Agricultural Universiry
第一节 种子生活力测定原理及方法
（2）磷酸缓冲液常用来配制四唑染色液（Ph6.5-7.5） (1)ISTA法： 母液I：9.078g KH2PO4溶解于1000ml蒸馏水；
母液Ⅱ： 9.472gNa2HP04 或11.876g Na2HPO4· 2O溶解于 2H
第一节 种子生活力测定原理及方法
2)种子预措
目的：采用适当的方法使胚的主要构造和(或)活的营
养组织暴露出来。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
方法：
刺穿：对经过预湿的种子或硬实种子，可利用解剖针或解
剖刀，刺穿种子的非主要部位，适用于小粒（牧草等）种子。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
（2）染色前的种子准备（预湿、预措） 1)种子预湿 目的： 软化种皮，方便样品准备；
促进活组织酶系统的活化，提高染色的均匀度。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
燕麦属和禾本科牧草 种子紧靠胚的上部横 切。
禾本科牧草种子 刺穿胚乳
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莴苣属和菊科中的其他属 通过子叶末端一半纵切，
纵切面表明似上述 第5种方式进行纵 切时的解剖刀部位
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(伞形科中的种和 其他具有直立胚 的种)沿胚的旁边 纵切
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第一节 种子生活力测定原理及方法
1950 年ISTA成立四唑测定技术委员会
Chairpersons of the ISTA Tetrazolium Committee Lakon Germany Lindenbein Germany Bulat Germany Moore USA Overa Norway Butler Australia Leist Germany Martinelli Argentine Krämer Germany
四唑染色
观察鉴定
结果报告
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第一节 种子生活力测定原理及方法
6、四唑测定方法 （1）试验样品 从净度分析后并经充分混合的净种子中，随机数取
100粒种子，4次重复。 如果是测定发芽试验末期休眠种子的生活力，则单用 发芽试验末期所发现的休眠种子。
方法：
①快速水浸预湿：适用于直接浸入水中不会造成组
织破裂损伤，不会影响鉴定正确性的种子；
②缓慢纸床预湿：适用于直接浸在水中容易破裂和
损伤的种子，以及衰弱的种子或过分干燥的种子；
③H2O2溶液浸种：为加快种子吸胀、促进酶的活化，
缩短预湿时间。
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的修订和补充，于1966年正式公布17个属和11个种 的林木种子可采用四唑染色法测定生活力。 1972年在挪威的奥斯陆会议上扩大到农业种子的 应用。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
1984年由ISTA瑞士秘书处正式发行 《四唑测定手 册》(Handbook On Tetrazolium Test) 。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
单子叶植物种子的胚和糊粉层、双子叶植物种子的胚和部 分双子叶植物的胚乳、裸子植物种子的胚等属于活组织； 种皮和禾谷类胚乳等为死组织，不能染色。 判断种子有无生活力，主要看胚和（或）胚乳（或配子体）
不染色坏死组织的部位及面积大小。
或在两端横切，打开胚腔，并 切去小部分胚乳(配子体组织) 针叶树种子沿胚旁 边纵切
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第一节 种子生活力测定原理及方法
（3）四唑染色
目的：通过染色反应，将胚和活的营养组织里的
健壮、衰弱和死亡部分的差异正确地显现出来。 染色程序： 将准备好的100×4种子放入适宜大小的培养皿或 烧杯中。 加入适宜浓度的四唑溶液，以淹没种子为度，移置 到一定温度的（黑暗或弱光）恒温箱内进行染色反应。
色情况。
20 ml乳酸＋20 ml苯酚＋40 ml甘油＋20 ml蒸馏水
注意
该药液有毒性，最好戴塑胶薄膜手套配 制，并在通风橱里操作。在使用时谨防 触及皮肤或衣服等。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
（4） H202 ：加快酶活化和吸胀。一般用0.3%H202溶液 （5）杀菌剂和抗生素：延缓衰弱种子的劣变进程。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
3、四唑测定的特点
①原理可靠；种子活细胞在呼吸过程中都会发生氧化还原反应 ②结果准确；结果与（标准）发芽率一般不会超过2％ ③不受休眠限制； ④方法简便；样品预处理、样品准备、染色、鉴定 ⑤省时快速；24h之内可出结果 ⑥成本低廉；恒温箱、培养皿、刀片、镊子、放大镜、四唑 世界公认的最有效的种子生活力测定方法
（一）种子生活力四唑染色测定 1、四唑测定的发展简史 1942年德国的H.Lakon(莱康) 发明
Prof.Dr.Georg Lakon Invent the topographical tetrazolium test 1939-1942 Chairman of ISTA Forest Tree Seed Committee 1928-1950
0.5%青霉素等抗菌素。
（6）硬化剂：有些种子（西瓜）浸种后，种皮表面出现
胶黏物质而变得非常光滑，难以拿牢进行样品准备，可用
硫酸钾K2SO4、硫酸铝Al2(SO4)3等硬化剂 。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
6、四唑测定方法
试验样品 染色前的准备（预湿、预措）
加速四唑还原成甲臜的速度；
温度25~45℃，每增加5 ℃，染色时间减半。
种子染色结束后，倾去溶液，用清水漂洗后鉴定。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
暂停染色：
因没有按时进行鉴定，可将正在进行染色的样品
移到低温或冰冻条件下，以中止或延缓染色反应进程
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第一节 种子生活力测定原理及方法
2、种子生活力测定在农业生产上的作用 ① 测定休眠种子的生活力，利于正确评定种子品
质、合理利用种子（发芽率低而生活力高） ；
② 快速预测种子发芽能力。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
二、种子生活力测定的原理及方法 1、生物化学法：四唑测定法、溴麝香草酚蓝法、
甲烯蓝法、中性红法和二硝基苯法等。
2、组织化学法：靛蓝染色法、红墨水染色法和
软x射线造影法等。
3、离体胚测定法：
4、荧光分析法：
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第一节 种子生活力测定原理及方法
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第一节 种子生活力测定原理及方法
一、种子生活力的概念和测定意义
1、种子生活力的概念
种子生活力：指种子发芽的潜在能力
或种胚所具有的生命力。 常用一批种子中具有生命力的种子 占种子总数的百分率来表示。
幼苗构造由种胚在发育期间 分化出来的组织衍生而来
第一节 种子生活力测定原理及方法
5、四唑测定法应用的化学试剂 （1）四唑 2，3，5—氯化(或溴化)三苯基四氮唑(四唑或红四 唑)，英文缩写TTC(TTB)或TZ。
分子式为C19H15N4Cl，分子量334.8，为白色或淡黄色
的粉剂，熔点243℃，易溶于水，具有微毒，见光易还原成
红色，棕色瓶包装，外包黑纸，存于暗处。 若溶液发红，便不能使用。
纵切：通过胚中轴和胚乳，纵向切开，使胚的主要构造暴
露出来，适用于具有直立胚的大粒禾本科等种子。
横切：沿种子非主要组织横向切断。
纵切
横切
先横切再纵切
刺穿
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禾谷类和禾本科牧草 种子通过胚或约在胚 乳四分之三处纵切
禾本科牧草种子 通过胚乳末端部 分横切和纵切
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第一节 种子生活力测定原理及方法
染色的温度和时间：染色时间因种子种类、样品
准备方法、本身生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH值
和温度等因素的不同而有差异，Biblioteka Baidu体参照表5~1(p64～68)
浓度高，染色快； 1%－测整胚种子 ；0.1%－测纵切种胚的种子
1000 ml蒸馏水之中。
2份母液I ＋3份母液Ⅱ混合即成。 (2)AOSA法：
1000 ml蒸馏水中加入5.45g NaH2PO4和3.79g Na2HPO4，充
分溶解即成。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
（3）乳酸苯酚透明液
用于染色后的小粒豆类和牧草种子，使种子种皮、稃 壳或胚乳变为透明，以便清楚地观察其胚主要构造的染
第一节 种子生活力测定原理及方法
染色失调：染色溶液变混浊、出现泡沫或粉红色的沉淀。 样品中含有死亡、衰弱、热伤、冻害或机械损伤的种子。
样品的胚与营养组织在预湿前已在水中或四唑溶液里浸过
染色溶液温度过高而引起种子组织(特别是衰弱组织)的
严重劣变，导致外溢物增加和微生物的活动。
真空技术的应用：
发芽率（适宜条件下）=
田间出苗率 ?
休眠种子，在适宜的条件下不一定都能发芽； 低活力种子，在适宜的条件下虽能萌发，但田 间不能形成正常幼苗。 96%和62%的发芽能否等同（ 1933，Goss）
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第五章 种子生活力与活力测定
第一节 种子生活力测定原理及方法 第二节 种子活力测定原理及方法
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第一节 种子生活力测定原理及方法
1953年爱尔兰都伯林ISTA世界大会第一次把四唑 测定列入国际种子检验规程，并规定7个属和1个种
的林木种子可应用该法测定生活力。
1956年法国巴黎、1959年挪威奥斯陆、1962年西
班牙里斯本、1965年德国慕尼黑，先后4次做了重大
Volume II, 1st Edition, 2003 Volume II - Tree and Shrub Species By N. Leist and S. Krämer Illustrated by J. Pfäfflin
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第一节 种子生活力测定原理及方法
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第一节 种子生活力测定原理及方法
4、四唑测定的适用范围
休眠种子； 新收获的种子；
发芽迟缓的种子；
发芽试验中未发芽的新鲜种子； 短时间急需知道种子的发芽潜力的种子。
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DPNH2 + TTC → DPN + TTCH + HCl
(辅酶IH2) (四唑) (辅酶I) (甲臜) (氯化氢)
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第一节 种子生活力测定原理及方法
（2）磷酸缓冲液常用来配制四唑染色液（Ph6.5-7.5） (1)ISTA法： 母液I：9.078g KH2PO4溶解于1000ml蒸馏水；
母液Ⅱ： 9.472gNa2HP04 或11.876g Na2HPO4· 2O溶解于 2H
第一节 种子生活力测定原理及方法
2)种子预措
目的：采用适当的方法使胚的主要构造和(或)活的营
养组织暴露出来。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
方法：
刺穿：对经过预湿的种子或硬实种子，可利用解剖针或解
剖刀，刺穿种子的非主要部位，适用于小粒（牧草等）种子。
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（2）染色前的种子准备（预湿、预措） 1)种子预湿 目的： 软化种皮，方便样品准备；
促进活组织酶系统的活化，提高染色的均匀度。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
燕麦属和禾本科牧草 种子紧靠胚的上部横 切。
禾本科牧草种子 刺穿胚乳
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莴苣属和菊科中的其他属 通过子叶末端一半纵切，
纵切面表明似上述 第5种方式进行纵 切时的解剖刀部位
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(伞形科中的种和 其他具有直立胚 的种)沿胚的旁边 纵切
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1950 年ISTA成立四唑测定技术委员会
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四唑染色
观察鉴定
结果报告
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6、四唑测定方法 （1）试验样品 从净度分析后并经充分混合的净种子中，随机数取
100粒种子，4次重复。 如果是测定发芽试验末期休眠种子的生活力，则单用 发芽试验末期所发现的休眠种子。
方法：
①快速水浸预湿：适用于直接浸入水中不会造成组
织破裂损伤，不会影响鉴定正确性的种子；
②缓慢纸床预湿：适用于直接浸在水中容易破裂和
损伤的种子，以及衰弱的种子或过分干燥的种子；
③H2O2溶液浸种：为加快种子吸胀、促进酶的活化，
缩短预湿时间。
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的修订和补充，于1966年正式公布17个属和11个种 的林木种子可采用四唑染色法测定生活力。 1972年在挪威的奥斯陆会议上扩大到农业种子的 应用。
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1984年由ISTA瑞士秘书处正式发行 《四唑测定手 册》(Handbook On Tetrazolium Test) 。
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单子叶植物种子的胚和糊粉层、双子叶植物种子的胚和部 分双子叶植物的胚乳、裸子植物种子的胚等属于活组织； 种皮和禾谷类胚乳等为死组织，不能染色。 判断种子有无生活力，主要看胚和（或）胚乳（或配子体）
不染色坏死组织的部位及面积大小。
或在两端横切，打开胚腔，并 切去小部分胚乳(配子体组织) 针叶树种子沿胚旁 边纵切
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（3）四唑染色
目的：通过染色反应，将胚和活的营养组织里的
健壮、衰弱和死亡部分的差异正确地显现出来。 染色程序： 将准备好的100×4种子放入适宜大小的培养皿或 烧杯中。 加入适宜浓度的四唑溶液，以淹没种子为度，移置 到一定温度的（黑暗或弱光）恒温箱内进行染色反应。
色情况。
20 ml乳酸＋20 ml苯酚＋40 ml甘油＋20 ml蒸馏水
注意
该药液有毒性，最好戴塑胶薄膜手套配 制，并在通风橱里操作。在使用时谨防 触及皮肤或衣服等。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
（4） H202 ：加快酶活化和吸胀。一般用0.3%H202溶液 （5）杀菌剂和抗生素：延缓衰弱种子的劣变进程。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
3、四唑测定的特点
①原理可靠；种子活细胞在呼吸过程中都会发生氧化还原反应 ②结果准确；结果与（标准）发芽率一般不会超过2％ ③不受休眠限制； ④方法简便；样品预处理、样品准备、染色、鉴定 ⑤省时快速；24h之内可出结果 ⑥成本低廉；恒温箱、培养皿、刀片、镊子、放大镜、四唑 世界公认的最有效的种子生活力测定方法
（一）种子生活力四唑染色测定 1、四唑测定的发展简史 1942年德国的H.Lakon(莱康) 发明
Prof.Dr.Georg Lakon Invent the topographical tetrazolium test 1939-1942 Chairman of ISTA Forest Tree Seed Committee 1928-1950
0.5%青霉素等抗菌素。
（6）硬化剂：有些种子（西瓜）浸种后，种皮表面出现
胶黏物质而变得非常光滑，难以拿牢进行样品准备，可用
硫酸钾K2SO4、硫酸铝Al2(SO4)3等硬化剂 。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
6、四唑测定方法
试验样品 染色前的准备（预湿、预措）
加速四唑还原成甲臜的速度；
温度25~45℃，每增加5 ℃，染色时间减半。
种子染色结束后，倾去溶液，用清水漂洗后鉴定。
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第一节 种子生活力测定原理及方法
暂停染色：
因没有按时进行鉴定，可将正在进行染色的样品
移到低温或冰冻条件下，以中止或延缓染色反应进程
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2、种子生活力测定在农业生产上的作用 ① 测定休眠种子的生活力，利于正确评定种子品
质、合理利用种子（发芽率低而生活力高） ；
② 快速预测种子发芽能力。
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二、种子生活力测定的原理及方法 1、生物化学法：四唑测定法、溴麝香草酚蓝法、
甲烯蓝法、中性红法和二硝基苯法等。
2、组织化学法：靛蓝染色法、红墨水染色法和
软x射线造影法等。
3、离体胚测定法：
4、荧光分析法：
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第一节 种子生活力测定原理及方法
一、种子生活力的概念和测定意义
1、种子生活力的概念
种子生活力：指种子发芽的潜在能力
或种胚所具有的生命力。 常用一批种子中具有生命力的种子 占种子总数的百分率来表示。
幼苗构造由种胚在发育期间 分化出来的组织衍生而来
第一节 种子生活力测定原理及方法
5、四唑测定法应用的化学试剂 （1）四唑 2，3，5—氯化(或溴化)三苯基四氮唑(四唑或红四 唑)，英文缩写TTC(TTB)或TZ。
分子式为C19H15N4Cl，分子量334.8，为白色或淡黄色
的粉剂，熔点243℃，易溶于水，具有微毒，见光易还原成
红色，棕色瓶包装，外包黑纸，存于暗处。 若溶液发红，便不能使用。
纵切：通过胚中轴和胚乳，纵向切开，使胚的主要构造暴
露出来，适用于具有直立胚的大粒禾本科等种子。
横切：沿种子非主要组织横向切断。
纵切
横切
先横切再纵切
刺穿
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禾谷类和禾本科牧草 种子通过胚或约在胚 乳四分之三处纵切
禾本科牧草种子 通过胚乳末端部 分横切和纵切
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染色的温度和时间：染色时间因种子种类、样品
准备方法、本身生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH值
和温度等因素的不同而有差异，Biblioteka Baidu体参照表5~1(p64～68)
浓度高，染色快； 1%－测整胚种子 ；0.1%－测纵切种胚的种子
1000 ml蒸馏水之中。
2份母液I ＋3份母液Ⅱ混合即成。 (2)AOSA法：
1000 ml蒸馏水中加入5.45g NaH2PO4和3.79g Na2HPO4，充
分溶解即成。
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（3）乳酸苯酚透明液
用于染色后的小粒豆类和牧草种子，使种子种皮、稃 壳或胚乳变为透明，以便清楚地观察其胚主要构造的染
第一节 种子生活力测定原理及方法
染色失调：染色溶液变混浊、出现泡沫或粉红色的沉淀。 样品中含有死亡、衰弱、热伤、冻害或机械损伤的种子。
样品的胚与营养组织在预湿前已在水中或四唑溶液里浸过
染色溶液温度过高而引起种子组织(特别是衰弱组织)的
严重劣变，导致外溢物增加和微生物的活动。
真空技术的应用：
发芽率（适宜条件下）=
田间出苗率 ?
休眠种子，在适宜的条件下不一定都能发芽； 低活力种子，在适宜的条件下虽能萌发，但田 间不能形成正常幼苗。 96%和62%的发芽能否等同（ 1933，Goss）
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第五章 种子生活力与活力测定
第一节 种子生活力测定原理及方法 第二节 种子活力测定原理及方法
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第一节 种子生活力测定原理及方法
1953年爱尔兰都伯林ISTA世界大会第一次把四唑 测定列入国际种子检验规程，并规定7个属和1个种
的林木种子可应用该法测定生活力。
1956年法国巴黎、1959年挪威奥斯陆、1962年西
班牙里斯本、1965年德国慕尼黑，先后4次做了重大
Volume II, 1st Edition, 2003 Volume II - Tree and Shrub Species By N. Leist and S. Krämer Illustrated by J. Pfäfflin
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4、四唑测定的适用范围
休眠种子； 新收获的种子；
发芽迟缓的种子；
发芽试验中未发芽的新鲜种子； 短时间急需知道种子的发芽潜力的种子。
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