实验十酵母核糖核酸的分离及组

3）磷酸
水浴
水解液1ml+定磷试剂1ml
观察现象
实验结果：
苔黑酚法测RNA的含量

1、标准曲线的绘制
0 1 0.4 1.6 2.0 2 0.8 1.2 2.0 3 1.2 0.8 2.0 4 1.6 0.4 2.0 5 2.0 0 2.0
RNA标准 0 液ml 蒸馏水 2.0 ml 苔黑酚 2.0 试剂ml
实验十 酵母核糖核酸的提取 及RNA的含量测定（苔黑酚法）
实验目的：
了解核酸的组分
掌握提取核酸和鉴定核酸组分的方法 掌握 苔黑酚法测定RNA含量的原理
和方法。
实验原理：
酵母中RNA含量较多, 含量可达2.67～ 10.0%，DNA很少（0.03～0.516％），提取 RNA以酵母最为理想。
一、核酸的水解 1. 碱水解
RNA的磷酯键易被碱水碱、DNA的磷酯键不易被碱水
解。例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以 完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下 则不受影响。这种水解性能上的差别，与RNA核糖基 上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解 时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形 成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。
2、组分鉴定 提取核酸+10%硫酸溶液5ml 10分钟 沸水浴 水解液
组分鉴定：
1）嘌呤碱:硝酸银溶液1ml +过量浓氨水, 出现沉淀到沉淀消失，再滴加1ml水解液， 观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。（注意 先后顺序） 2）核糖 水解液0.5ml+苔黑酚三氯化铁 溶液1ml，加热至沸1分钟，观察溶液颜色 变化。
RNA可溶于碱性溶液，研磨后离心去除 沉淀（细胞碎片），当碱被中和后，上清 液中加入乙醇可以使解聚的核糖核酸沉淀， 离心弃上清液，可得到RNA的粗制品。
HOCH2 H H
O H
OH H
HOCH2 H H
O H
OH H
OHห้องสมุดไป่ตู้
OH
OH
H
D-核糖
D-2-脱氧核糖
RNA versus DNA - Stability issues
混匀，沸水浴25—45min,冷却，测各管 A670nm,以A670nm为纵坐标，RNA量（ug） 为横坐标作图。

2、样品的测定 1.0ml样液+1.0ml蒸馏水+2.0ml苔黑酚 试剂，混匀，沸水浴25—45min,测A670nm， 根据标准曲线求得RNA的质量（ug）.
试剂：
0.2%氢氧化钠溶液、5%硝酸银溶液
冰醋酸、干酵母、
95%乙醇 、10%硫酸溶液、浓氨水
苔黑酚三氯化铁溶液
定磷试剂
（1）17%硫酸溶液 到83ml水中。 将17ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入
（2）2.5%钼酸铵溶液
将2.5g钼酸铵溶于100ml水中。
（3）10%抗坏血酸溶液 10g抗坏血酸溶于100ml 水中，贮棕色瓶保存。溶液呈淡黄色时可用，如 呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸。 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。 17%硫酸溶液：2.5%钼酸铵溶液：10%抗坏血酸 溶液：水=1:1:1:2(V/V)
操作
1、提取核糖核酸
5g酵母+30ml0.2%氢氧化钠 研磨均匀 锥形瓶，微波加热5分钟，冷却，离心 （4000r/min）10分钟，取上清液，滴加 冰醋酸使提取液呈酸性（pH5—6，石蕊试 纸试之），加30ml95%乙醇溶液。注意要 一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀 完全，离心（3000r/min）3分钟，95%乙 醇（每次约10ml）洗涤沉淀两次（即离 心）。
（2）嘌呤碱+AgNO3
H3PO4+ 12H2MoO4
浓氨水
嘌呤碱的银化物
H2MoO4+(NH4)2SO4
（3）（NH4)2MoO4+H2SO4
H3P(Mo3O10)4+12H2O
+
抗坏血酸
钼蓝 （660nm）
器材和试剂
器材： 乳钵、150ml锥形瓶、水浴锅、
量筒、吸管、滴管、试管及试管架、烧 杯、离心机、漏斗
一、核酸的水解 2.酸水解 核酸分子中的糖苷键和磷酸二酯键 在酸性条件下水解切断。其中糖苷键比 磷酸二酯键更容易遭到水解。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱 和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解， 从水解液中可以测出上述组分的存在。 （1）核糖
H+
糠醛
糠醛+甲基苯二酚（地衣酚、苔黑酚）
Fe3+
鲜绿色的复合物（ 670nm ）