酵母核糖核酸的提取及测定

酵母核糖核酸的提取及测定

一、实验背景及目的

核糖核酸(RNA)和它的降解物核苷酸、核苷及其衍生物在生物化学、医药、食品添加剂、农业等领域有着广泛的应用。比如能够促进作物的生长，在水稻、小麦、柑橘及多种蔬菜生产中应用，取得了明显的增产效果。像鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)还是强力助鲜剂，胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料。而利用微生物资源提取氨基酸、核苷酸等生物小分子，具有成本低、非化学合成、无毒、无害的特点。[1] 随着啤酒等发酵行业的快速发展，产生了相应的大量发酵副产物，如何利用这些副产物，既做到不污染环境，还能产生良好的经济效益，一直是研究的热点。而啤酒废酵母中RNA含量达6%~8%，是生产RNA的较好原料，此外，抽提后的菌体蛋白质(占干菌体的50%)还具有很高的利用价值。所以利用啤酒废酵母生产RNA形成了非常有益的产业链。[2] 本实验目的就是学习从酵母中提取RNA的方法并掌握其测定手段。

二、实验原理

微生物是工.业上大量生产核酸的原料，其中以酵母最为理想，酵母核酸中主要是RMA (2.67~10.0%)，DNA很少(0.03~0.516%)，菌体容易收集，RMA也易于分离。RMA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去，再根据RNA等电点在pH2. 0~2.5的特点，将体系pH调至其等电点，使之沉淀，进行离心收集。

提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用碱使细菌细胞壁水解，使RNA释放出来，浓盐法是在加热条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，RNA 钠盐易溶于水，在含盐的菌体溶液中，RVA有较高的溶解度。二者均通过控制温度使蛋白质变性沉淀，通过离心将RNA及蛋白质和酵母菌体分离，进而在等电点沉淀RNA，从而达到提取目的。本实验采用浓盐法(10% NaCl),是食品医药卫生领域制备RNA 制剂的经典方案。[1][3]

核酸不论是DNA还是RNA,都是由核普酸组成的多聚核苷酸化合物，而核甘酸是由戊糖、碱基和磷酸构成，三个组份是以等分子比例存在。所以测定核酸的含员，只需测定组成核苷酸的任一成份，如磷、糖或碱基，便可相应计算山核酸的含量。

目前测定核酸含量的方法主要有:

1、定磷法，测量RNA和DNA:无机消化法。(蛋白质含量测定:凯氏定氮法)

2、戊糖测定法，测RNA: 苔黑酚法

3、脱氧戊糖测定法，测DNA:二苯胺法

4、紫外吸收法测定RNA和IDNA:碱基平面的共轭双键在紫外区具特异光吸收

后三种都是设计利用的比色法。

本实验采用紫外吸收法来测定并计算所获制品RNA的含量，再计算收率。

三、实验材料，仪器和试剂

1.材料:干酵母片粉

2.仪器:低温冷冻离心机（Eppendorf 5804R离心机）、恒温烘箱（202-2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司）、电子天平（FA1004 上皿电子天平，上海精科）、紫外分光光度计（WFZ UV-2000型，尤尼柯仪器有限公司）、小台秤。(记录厂家及型号); pH计(本次实验:精密试纸pH0.5-5.0,精密试纸pH5.0-9.0)

主要器皿:移液器、研钵、三角瓶、容量瓶、烧杯

3.试剂: 10%NaCl、6MHCl、 95%乙醇(分析纯)、3~5%的氨水、RNA沉淀剂。

RNA沉淀剂：取0.5克钼酸铵，加水193ml，加7mL 70%过氯酸，总体积200ml. (70%过氯酸即高氯酸，原液浓度即是70%)。

四、实验步骤

浓盐法提取RNA工艺流程:

酵母液→盐处理→高温浸提→骤冷→离心分离→等电点沉淀→乙醇洗涤→干燥→纯度检测[4]

具体操作:

1.提取

称取7g酵母粉，置研钵中。量取50ml 10%NaCl溶液备用。加入适量NaCl于研钵中，充分研磨调和均匀，彻底悬浮无颗粒。转入三角瓶，用剩余的NaCl少量多次将研钵研杵洗涤干净并入三角瓶混匀。之后小心放入沸水浴中，开始加热时用玻棒搅拌一分钟左右使悬浮浸提体系迅速均匀升温至80C以上。浸提40分钟。

2.分离

将上述提取液取出，于冰浴中迅速冷却7分钟，转入离心管，4℃下, 4500转/分离心30分钟，使提取液及菌体残渣等分离。留取上清液。

3.沉淀RNA

将离心得到的上清液，小心倾倒于50mL小烧杯中，并置于冰浴上冷却，并于冰浴中，在搅拌下(注意不要过分剧烈)小心地用6MHCl调节pH至2.0~2.5。随着pH下降，溶液中白色沉淀逐渐增加，到等电点时RNA溶解度最低(注意严格控制pH)，调好后继续于冰水中放置至少10分钟使沉淀充分，颗粒变大。

4.乙醇洗涤

上述悬浮液小心转入离心管，以3000转/分离心10分钟，得到RNA沉淀。小心倾去上清液，直接于离心管中用95%乙醇洗涤RNA沉淀三次，每次用10毫升乙醇,充分搅拌洗涤，然后以3000转/分离心5分钟。

5.干燥

用干燥药勺仔细将洗涤后的RNA沉淀从离心管内挖出涂布于事先将边缘折起成框的硫酸纸上(此硫酸紙要预先用分析天平称重并记录数据)，涂布均匀后小心置于80℃烘箱内5分钟左右，使沉淀充分干燥。

将干燥后的RNA制品连同硫酸纸一齐准确称重，而后小心将RNA制品的绝大部分转移至一小烧杯中，将硫酸纸及残余RNA制品再次称重，记录下所有数据，以求得RNA总制品重量及定量样品重量，用以计算RNA含量。

6.含量测定(紫外分光光度法)

采用比消光系数法，比消光系数是指单位浓度的核酸溶液的消光值A260(1μg/mL RNA 的消光值)，本实验给定A260 =0.022。

测定步骤:

将大部分制品转入匀浆器，加4mL蒸馏水小心沉稳将RNA匀浆，打匀后转入小烧杯，用12mL蒸馏水分三次洗涤匀浆器，并入小烧杯，调节pH7.0。最后转入25mL容量瓶，用蒸馏水定容混匀。

取2支试管，按下表操作:

表1.实验操作步骤

摇匀，冰浴20分钟，然后转入离心管3500转/分离心10分钟，小心留取上清液，各取0.5ml 分别至两个50ml容量瓶中，用蒸馏水定容，然后用B管做标准空白液在紫外分光光度计上