鼻咽癌细胞外囊泡标志物的筛选与表征
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本课题组首创性地研制成功具有自主知识产权、国际上最灵敏的纳米流式检测装置（nano-flowcytometer, nFCM），将病毒、二氧化硅纳米颗粒、纳米金的单颗粒检测下限分别推进到前所未有的27 nm、24 nm和7 nm，较传统流式细胞仪的散射检测灵敏度提升了4-6个数量级。nFCM的荧光灵敏度则较传统流式提高了2-3个数量级，实现了3个Alexa Fluor 555分子和单个藻红蛋白荧光信号的检测，为EVs的单颗粒水平高通量、多参数定量表征奠定了基础。
EVs通过膜上的蛋白质、脂类等信号分子，以及膜内包裹的内含物（激素、核酸和细胞因子等）影响着受体细胞的表型和功能[6][7]。越来越多的研究表明EVs在癌症生物学的许多方面发挥着核心作用，例如癌症转移和癌症免疫等[8][9]。在作为药物运输载体方面，与人工合成的纳米颗粒相比，EVs具有免疫原性小、体内循环时间长和器官靶向性等优点，在开发新型纳米药物中也展现了巨大的应用潜力和市场价值[10][11]。此外，EVs在癌症诊断、转移预测、预后分析和治疗监控中均显示出巨大的应用前景[12][13]。
本论文基于颜晓梅老师课题组研发成功具有自主知识产权的纳米流式检测装置（nano-flow cytometer, nFCM），对鼻咽癌来源的细胞外囊泡进行单颗粒多参数表征，揭示了鼻咽癌来源的EVs颗粒之间的异质性，检测并筛选出能够特异性表征鼻咽癌的蛋白标志物，并初步应用于鼻咽癌临床样本的检测。
1.2 研究内容与Vs浓度、纯度及粒径的表征
不论是鼻咽癌细胞上清还是临床血浆样本，其生理环境均较复杂，其中不止含有EVs，还含有大量的脂蛋白。据文献报道，脂蛋白的大小与EVs，尤其是外泌体在粒径（30-150 nm）和密度（1.10-1.19 g/mL）上有高度重叠[5]。然而至今为止仍然缺乏能够使得这两者区分的有效方法，因此提纯样本中或多或少均会带有脂蛋白。脂蛋白的存在会影响EVs蛋白质含量等分析，因此“纯度”为提纯EVs样本较重要的因素之一。另外，提纯EVs的其他物理因素包括粒径，浓度，形态等也会影响下游对于EVs功能性的研究。
基于细胞外泌囊泡相关的生物标志物的开发，无疑需要精确、快速的表征技术作为重要支撑。然而，EVs粒径极其微小、携载的蛋白、核酸、脂类等“货物分子”含量极低，而且因细胞来源、细胞状态以及分泌途径的不同使得EVs个体间存在着高度的异质性和多样性，即使来源于同一种细胞的EVs的个体在其物理和生物化学性质方面也存在着极大的异质性[16][17]。
EBV感染宿主细胞后，其细胞膜上会表达有EB病毒来源的膜蛋白LMP1，LMP2A，核内蛋白EBNA1，以及一些EBER RNA[1]（图1）。鼻咽癌来源的EVs也会携载这些来自本体细胞的特殊信息，这能直间或间接的反应细胞或病人的生理状态，目前越来越多研究在寻找合适的EV内含物作为鼻咽癌非侵入性检测的潜在生物标志物[14][15]。
3. 临床血液样本中EVs的多参数检测及其在癌症诊断中的应用（第四章）：基于nFCM散射光和荧光同时检测的性能，通过对200L血浆中LMP1/LMP2A阳性EVs的颗粒浓度测定，结合免疫荧光标记策略，可实现单个EVs表面蛋白LMP1/LMP2A表达效率检测。通过对临床血浆样本中细胞外囊泡多参数检测方法的构建，实现了血浆中表达不同表面蛋白EVs的检测，并对其在血浆中的绝对浓度进行标定，其结果显示有望开发两种EBV特异性的蛋白为临床上有效检测鼻咽癌的标志物。
因此，本章首先利用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）表征提纯出来的EVs；再利用nFCM，成功实现了对粒径低至40 nm EVs的浓度、纯度、粒径的物理性质分析。
基于以上的研究背景和基础、实验室已经建立的细胞外囊泡的单颗粒水平表征新方法，本论文主要利用纳米流式检测装置高灵敏、高通量、多参数地检测鼻咽癌来源的细胞外囊泡。本论文的主要内容包括以下几个方面：
1. 鼻咽癌细胞外囊泡无标记表征（第二章）：nFCM具有极高灵敏的散射光检测性，成功实现了对粒径低至40 nm EVs的无标记散射光分析。EVs作为一种具有磷脂双层膜结构的纳米级小囊泡，通过对比Triton X-100裂解前后样本中的颗粒数目，定量表征细胞上清和血浆中所得的EVs样本纯度。选用折射率与EVs接近的二氧化硅纳米颗粒作为粒径标准品，并采用米氏散射理论对由于折射率差异所引起的散射光强差异进行校正，通过绘制EVs散射光强与粒径的标准工作曲线，实现了鼻咽癌EVs粒径分布的精准标定。
2.鼻咽癌细胞外囊泡表面蛋白表征及标志物的初筛（第三章）：相对于粒径等物理性质，EVs的蛋白、核酸、脂质等信号分子的生化性质在其生物功能的行使中更具意义。nFCM具备散射光和荧光同时检测的性能，结合免疫荧光标记，测定了鼻咽细胞来源EVs上某一特定蛋白CD63,CD9, CD81, LMP1及LMP2A等表面蛋白的标记比例。
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是各种细胞均能分泌到细胞外基质的纳米尺度的膜性小囊泡，主要分为粒径为30 nm-120 nm的由多泡小体分泌的外泌体（exosomes）和粒径为100 nm-1000 nm的从细胞膜出芽脱落的微囊泡（microvesicles）[4][5]（如图1-1所示）。
1 绪论
1.1 引言
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一种发生在鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。虽然鼻咽癌病例在世界范围内并不常见，但是其在东南亚地区尤其在中国南部发病率较高（每100,000个体中约有25-30病例）[1]。鼻咽癌可多因素引发，包括病毒、遗传和环境因素等。在亚洲，大部分鼻咽癌患者体内均含有EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV），初期均无明显感染症状[1][2]，且具有早期转移的倾向[3]。而目前鼻咽癌的诊断金标准仍为组织活检技术，耗时长，入侵性强，肿瘤的异质性也使得检测准确度大大降低。因此寻找一种准确、快速地诊断早期鼻咽癌的新型手段具有十分重要的意义。
EVs通过膜上的蛋白质、脂类等信号分子，以及膜内包裹的内含物（激素、核酸和细胞因子等）影响着受体细胞的表型和功能[6][7]。越来越多的研究表明EVs在癌症生物学的许多方面发挥着核心作用，例如癌症转移和癌症免疫等[8][9]。在作为药物运输载体方面，与人工合成的纳米颗粒相比，EVs具有免疫原性小、体内循环时间长和器官靶向性等优点，在开发新型纳米药物中也展现了巨大的应用潜力和市场价值[10][11]。此外，EVs在癌症诊断、转移预测、预后分析和治疗监控中均显示出巨大的应用前景[12][13]。
本论文基于颜晓梅老师课题组研发成功具有自主知识产权的纳米流式检测装置（nano-flow cytometer, nFCM），对鼻咽癌来源的细胞外囊泡进行单颗粒多参数表征，揭示了鼻咽癌来源的EVs颗粒之间的异质性，检测并筛选出能够特异性表征鼻咽癌的蛋白标志物，并初步应用于鼻咽癌临床样本的检测。
1.2 研究内容与Vs浓度、纯度及粒径的表征
不论是鼻咽癌细胞上清还是临床血浆样本，其生理环境均较复杂，其中不止含有EVs，还含有大量的脂蛋白。据文献报道，脂蛋白的大小与EVs，尤其是外泌体在粒径（30-150 nm）和密度（1.10-1.19 g/mL）上有高度重叠[5]。然而至今为止仍然缺乏能够使得这两者区分的有效方法，因此提纯样本中或多或少均会带有脂蛋白。脂蛋白的存在会影响EVs蛋白质含量等分析，因此“纯度”为提纯EVs样本较重要的因素之一。另外，提纯EVs的其他物理因素包括粒径，浓度，形态等也会影响下游对于EVs功能性的研究。
基于细胞外泌囊泡相关的生物标志物的开发，无疑需要精确、快速的表征技术作为重要支撑。然而，EVs粒径极其微小、携载的蛋白、核酸、脂类等“货物分子”含量极低，而且因细胞来源、细胞状态以及分泌途径的不同使得EVs个体间存在着高度的异质性和多样性，即使来源于同一种细胞的EVs的个体在其物理和生物化学性质方面也存在着极大的异质性[16][17]。
EBV感染宿主细胞后，其细胞膜上会表达有EB病毒来源的膜蛋白LMP1，LMP2A，核内蛋白EBNA1，以及一些EBER RNA[1]（图1）。鼻咽癌来源的EVs也会携载这些来自本体细胞的特殊信息，这能直间或间接的反应细胞或病人的生理状态，目前越来越多研究在寻找合适的EV内含物作为鼻咽癌非侵入性检测的潜在生物标志物[14][15]。
3. 临床血液样本中EVs的多参数检测及其在癌症诊断中的应用（第四章）：基于nFCM散射光和荧光同时检测的性能，通过对200L血浆中LMP1/LMP2A阳性EVs的颗粒浓度测定，结合免疫荧光标记策略，可实现单个EVs表面蛋白LMP1/LMP2A表达效率检测。通过对临床血浆样本中细胞外囊泡多参数检测方法的构建，实现了血浆中表达不同表面蛋白EVs的检测，并对其在血浆中的绝对浓度进行标定，其结果显示有望开发两种EBV特异性的蛋白为临床上有效检测鼻咽癌的标志物。
因此，本章首先利用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）表征提纯出来的EVs；再利用nFCM，成功实现了对粒径低至40 nm EVs的浓度、纯度、粒径的物理性质分析。
基于以上的研究背景和基础、实验室已经建立的细胞外囊泡的单颗粒水平表征新方法，本论文主要利用纳米流式检测装置高灵敏、高通量、多参数地检测鼻咽癌来源的细胞外囊泡。本论文的主要内容包括以下几个方面：
1. 鼻咽癌细胞外囊泡无标记表征（第二章）：nFCM具有极高灵敏的散射光检测性，成功实现了对粒径低至40 nm EVs的无标记散射光分析。EVs作为一种具有磷脂双层膜结构的纳米级小囊泡，通过对比Triton X-100裂解前后样本中的颗粒数目，定量表征细胞上清和血浆中所得的EVs样本纯度。选用折射率与EVs接近的二氧化硅纳米颗粒作为粒径标准品，并采用米氏散射理论对由于折射率差异所引起的散射光强差异进行校正，通过绘制EVs散射光强与粒径的标准工作曲线，实现了鼻咽癌EVs粒径分布的精准标定。
2.鼻咽癌细胞外囊泡表面蛋白表征及标志物的初筛（第三章）：相对于粒径等物理性质，EVs的蛋白、核酸、脂质等信号分子的生化性质在其生物功能的行使中更具意义。nFCM具备散射光和荧光同时检测的性能，结合免疫荧光标记，测定了鼻咽细胞来源EVs上某一特定蛋白CD63,CD9, CD81, LMP1及LMP2A等表面蛋白的标记比例。
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是各种细胞均能分泌到细胞外基质的纳米尺度的膜性小囊泡，主要分为粒径为30 nm-120 nm的由多泡小体分泌的外泌体（exosomes）和粒径为100 nm-1000 nm的从细胞膜出芽脱落的微囊泡（microvesicles）[4][5]（如图1-1所示）。
1 绪论
1.1 引言
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一种发生在鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。虽然鼻咽癌病例在世界范围内并不常见，但是其在东南亚地区尤其在中国南部发病率较高（每100,000个体中约有25-30病例）[1]。鼻咽癌可多因素引发，包括病毒、遗传和环境因素等。在亚洲，大部分鼻咽癌患者体内均含有EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV），初期均无明显感染症状[1][2]，且具有早期转移的倾向[3]。而目前鼻咽癌的诊断金标准仍为组织活检技术，耗时长，入侵性强，肿瘤的异质性也使得检测准确度大大降低。因此寻找一种准确、快速地诊断早期鼻咽癌的新型手段具有十分重要的意义。