鼻咽癌细胞外囊泡标志物的筛选与表征

1 绪论
1.1 引言
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一种发生在鼻咽黏膜上皮细胞的恶性肿瘤。虽然鼻咽癌病例在世界范围内并不常见，但是其在东南亚地区尤其在中国南部发病率较高（每100,000个体中约有25-30病例）[1]。鼻咽癌可多因素引发，包括病毒、遗传和环境因素等。在亚洲，大部分鼻咽癌患者体内均含有EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV），初期均无明显感染症状[1][2]，且具有早期转移的倾向[3]。而目前鼻咽癌的诊断金标准仍为组织活检技术，耗时长，入侵性强，肿瘤的异质性也使得检测准确度大大降低。因此寻找一种准确、快速地诊断早期鼻咽癌的新型手段具有十分重要的意义。
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是各种细胞均能分泌到细胞外基质的纳米尺度的膜性小囊泡，主要分为粒径为30 nm-120 nm的由多泡小体分泌的外泌体（exosomes）和粒径为100 nm-1000 nm的从细胞膜出芽脱落的微囊泡（microvesicles）[4][5]（如图1-1所示）。
EVs通过膜上的蛋白质、脂类等信号分子，以及膜内包裹的内含物（激素、核酸和细胞因子等）影响着受体细胞的表型和功能[6][7]。越来越多的研究表明EVs在癌症生物学的许多方面发挥着核心作用，例如癌症转移和癌症免疫等[8][9]。在作为药物运输载体方面，与人工合成的纳米颗粒相比，EVs具有免疫原性小、体内循环时间长和器官靶向性等优点，在开发新型纳米药物中也展现了巨大的应用潜力和市场价值[10][11]。此外，EVs在癌症诊断、转移预测、预后分析和治疗监控中均显示出巨大的应用前景[12][13]。
EBV感染宿主细胞后，其细胞膜上会表达有EB病毒来源的膜蛋白LMP1，LMP2A，核内蛋白EBNA1，以及一些EBER RNA[1]（图1）。鼻咽癌来源的EVs也会携载这些来自本体细胞的特殊信息，这能直间或间接的反应细胞或病人的生理状态，目前越来越多研究在寻找合适的EV内含物作为鼻咽癌非侵入性检测的潜在生物标志物[14][15]。
基于细胞外泌囊泡相关的生物标志物的开发，无疑需要精确、快速的表征技术作为重要支撑。然而，EVs粒径极其微小、携载的蛋白、核酸、脂类等“货物分子”含量极低，而且因细胞来源、细胞状态以及分泌途径的不同使得EVs个体间存在着高度的异质性和多样性，即使来源于同一种细胞的EVs的个体在其物理和生物化学性质方面也存在着极大的异质性[16][17]。
本论文基于颜晓梅老师课题组研发成功具有自主知识产权的纳米流式检测装置（nano-flow cytometer, nFCM），对鼻咽癌来源的细胞外囊泡进行单颗粒多参数表征，揭示了鼻咽癌来源的EVs颗粒之间的异质性，检测并筛选出能够特异性表征鼻咽癌的蛋白标志物，并初步应

用于鼻咽癌临床样本的检测。
1.2 研究内容与方法
本课题组首创性地研制成功具有自主知识产权、国际上最灵敏的纳米流式检测装置（nano-flowcytometer, nFCM），将病毒、二氧化硅纳米颗粒、纳米金的单颗粒检测下限分别推进到前所未有的27 nm、24 nm和7 nm，较传统流式细胞仪的散射检测灵敏度提升了4-6个数量级。nFCM的荧光灵敏度则较传统流式提高了2-3个数量级，实现了3个Alexa Fluor 555分子和单个藻红蛋白荧光信号的检测，为EVs的单颗粒水平高通量、多参数定量表征奠定了基础。
基于以上的研究背景和基础、实验室已经建立的细胞外囊泡的单颗粒水平表征新方法，本论文主要利用纳米流式检测装置高灵敏、高通量、多参数地检测鼻咽癌来源的细胞外囊泡。本论文的主要内容包括以下几个方面：
1. 鼻咽癌细胞外囊泡无标记表征（第二章）：nFCM具有极高灵敏的散射光检测性，成功实现了对粒径低至40 nm EVs的无标记散射光分析。EVs作为一种具有磷脂双层膜结构的纳米级小囊泡，通过对比Triton X-100裂解前后样本中的颗粒数目，定量表征细胞上清和血浆中所得的EVs样本纯度。选用折射率与EVs接近的二氧化硅纳米颗粒作为粒径标准品，并采用米氏散射理论对由于折射率差异所引起的散射光强差异进行校正，通过绘制EVs散射光强与粒径的标准工作曲线，实现了鼻咽癌EVs粒径分布的精准标定。
2.鼻咽癌细胞外囊泡表面蛋白表征及标志物的初筛（第三章）：相对于粒径等物理性质，EVs的蛋白、核酸、脂质等信号分子的生化性质在其生物功能的行使中更具意义。nFCM具备散射光和荧光同时检测的性能，结合免疫荧光标记，测定了鼻咽细胞来源EVs上某一特定蛋白CD63,CD9, CD81, LMP1及LMP2A等表面蛋白的标记比例。
3. 临床血液样本中EVs的多参数检测及其在癌症诊断中的应用（第四章）：基于nFCM散射光和荧光同时检测的性能，通过对200?L血浆中LMP1/LMP2A阳性EVs的颗粒浓度测定，结合免疫荧光标记策略，可实现单个EVs表面蛋白LMP1/LMP2A表达效率检测。通过对临床血浆样本中细胞外囊泡多参数检测方法的构建，实现了血浆中表达不同表面蛋白EVs的检测，并对其在血浆中的绝对浓度进行标定，其结果显示有望开发两种EBV特异性的蛋白为临床上有效检测鼻咽癌的标志物。
2 鼻咽癌来源的细胞外囊泡无标记表征
2.1 鼻咽癌来源的EVs浓度、纯度及粒径的表征
不论是鼻咽癌细胞上清还是临床血浆样本，其生理环境均较复杂，其中不止含有EVs，还含有大量的脂蛋白。据文献报道，脂蛋白的大小与EVs，尤其是外泌体在粒径（30-150 nm）和密度（1.10-1.19 g/mL）上有高度重叠[5]。然而至今为止仍然缺

乏能够使得这两者区分的有效方法，因此提纯样本中或多或少均会带有脂蛋白。脂蛋白的存在会影响EVs蛋白质含量等分析，因此“纯度”为提纯EVs样本较重要的因素之一。另外，提纯EVs的其他物理因素包括粒径，浓度，形态等也会影响下游对于EVs功能性的研究。
因此，本章首先利用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）表征提纯出来的EVs；再利用nFCM，成功实现了对粒径低至40 nm EVs的浓度、纯度、粒径的物理性质分析。
2.2 实验部分
2.2.1 实验原理
Triton-X 100是一种表面活性剂，可以裂解细胞外囊泡的膜状结构，但是对脂蛋白等杂质颗粒并无裂解作用[18][19]，且裂解后的碎片无法被nFCM检测。因此通过对比适当浓度的Triton-X 100裂解EVs样本前后的颗粒数，即可测定样本中EVs纯度。下图为Triton-X 100裂解外泌体原理图。
选用折射率与EVs接近的二氧化硅纳米颗粒作为粒径标准品，并采用米氏散射理论对由于折射率差异所引起的散射光强差异进行校正，通过绘制EVs散射光强与粒径的标准工作曲线，实现了EVs粒径分布的精准标定[20]。nFCM的分析速率高达每分钟10,000个颗粒，仅需几分钟即可获得具有高度统计代表性的EVs粒径分布特征，分辨率和准确性媲美冷冻透射电镜。
利用nFCM检测一系列已知浓度的100 nm聚苯乙烯荧光标准球，建立每分钟的颗粒数颗粒数与标准球浓度的标准曲线，后在相同的仪器状态下检测样本中的颗粒数，代入标准曲线即可计算出样本中EVs浓度。
2.2.2 实验仪器与试剂
1. 实验仪器
纳米流式检测装置（nano-flow cytometer, nFCM），如下图所示。
Nu-425-600E生物安全柜：购于NuAire公司，用于细胞传代和保种等操作；
3111水套CO2培养箱：购于ThermoFisher Scientific公司，用于细胞培养；
冷冻离心机5810R：购于Eppendorf公司，用于50 mL离心管中样品离心；
生物光学显微镜：购于广州粤显光学仪器公司，用于细胞培养时观察细胞形态；
900 series超低温冰箱：购于ThermoFisher Scientific公司，用于细胞短期冻存；
超纯水机：购于LabWater公司，制备超纯水用于nFCM流式系统鞘液、溶液配制等；
OptimaTM XE-90 Ultracentrifuge：购于 Beckmann Coulter公司，用于EVs的纯化以及制备去除EVs的胎牛血清，每管12.5 mL；
OptimaTMMAX-XP Ultracentrifuge：购于 Beckmann Coulter公司，用于EVs的纯化以及制备去除EVs的胎牛血清，每管1.0 mL；
2. 实验试剂
鼻咽正常上皮细胞NP69细胞系：由厦门大学附属第一医院提供
鼻咽癌（EBV+）上皮细胞C666-1细胞系：由厦门大学附属第一医院提供
TBD 人角质细胞-SFM无血清培养基
Gibco RPMI 1640培养基
0.25%胰酶溶液：称量0.25 g胰蛋白酶加入100 mL PBS 中，4 °C过夜溶解，过0.22 ?m膜

除菌，保存于4 °C。
PBS缓冲液（pH7.4）：称取4.00 g NaCl，0.10 g KCl，1.74 g Na2HPO4·12H2O 和 0.12 g KH2PO4，加入500 mL超纯水，高压灭菌，冷却后，过0.22 ?m膜，4 °C 密封保存。
Triton X-100：购于Sigma-Alorich公司，用于裂解EVs
2.2.3 实验步骤
1. 鼻咽癌来源EVs浓度表征
采用800 g， 4 °C对收集的细胞培养上清离心5 min，弃去细胞沉淀，将上清液转移至新的离心管中；2,000 g，4 °C离心10 min进一步去除上清液中的残存细胞碎片。将去除细胞及细胞碎片的细胞培养基转移至超离管中，利用配备SW41Ti转头的Optima XE-90 Ultracentrifuge超速离心机在100,000 g，4 °C条件下离心2小时，采用50 ?L PBS重悬后移至OptimaTM MAX-XP Ultracentrifuge超速离心机，补充至1 mL后，100,000 g，4 °C离心17 min，再用50 ?L PBS重悬。
将浓度为2*1010 particle/mL的100 nm聚苯乙烯荧光标准球逐级稀释（3倍逐级稀释）为五个标准品，每个标准品准备三份平行样，于nFCM上测定每分钟的颗粒数，每个平行样测定三次，取每一种标准品的平均值颗粒数与标准球浓度拟合标准曲线，后在相同的仪器状态下检测制备的EVs样本中的颗粒数，代入标准曲线计算出样本中EVs浓度。
2. 鼻咽癌来源EVs纯度表征
取100 ?L Triton X-100加入至900 ?L PBS缓冲液中，配置10% Triton X-100溶液，随后在45?L的EVs样本中加入5 ?L 10% Triton X-100，即形成1% Triton X-100处理EVs样本，放置于冰上孵育30 min，每隔5 min涡旋10-15 s。用PBS稀释20倍或更高倍数后利用nFCM对其进行分析。
3. 鼻咽癌来源EVs粒径表征
采用折射率与EVs（RI ≈ 1.40）接近的SiNPs（RI = 1.461）[20]作为EVs粒径测量的标准品，将粒径为47 nm，59 nm，74 nm，95 nm，123 nm五种SiNPs经nFCM测定后，绘制散射光强与粒径的标准工作曲线，在相同仪器条件下对EVs样本进行检测，将EVs的散射光强代入该标准工作曲线即可对制备的EVs的粒径分布进行标定。
2.3 实验结果与讨论
2.3.1 两种细胞系来源EVs TEM表征
为了确保分析物确实为细胞外囊泡，结合厦门大学公共卫生学院的透射电子显微镜(Transmission electron microscope, TEM)，我们对NP69和C666-1两种细胞来源的EVs样本进行了形貌表征，其结果如图2-3，其中图A为NP69 EVs，图B为C666-1 EVs。图上所示的形貌特征与文献中报道的茶拖状结构相似（如红色箭头所指）[4]，为典型的EV膜结构。
2.3.2 鼻咽癌来源EVs浓度表征
将NP69，C666-1 EVs样本稀释至合适倍数后于nFCM上检测。将已知浓度的100 nm聚苯乙烯荧光球逐级稀释，作为浓度标准品，在相同的仪器状态下检测1分钟内的颗粒数，并绘制浓度-颗粒数的标准工作曲线。
将NP69/C666-1 EVs样本的颗粒数代入即可计算外泌体的浓度。A图分别为两种样本在nFCM上的散射光