小鼠胚胎成纤维细胞培养实验

0234091班 81人灾害毒理学实验

实验一小鼠胚胎成纤维细胞培养实验

一．实验目的

明确细胞培养室的建设与日常管理规定，了解细胞培养实验中常用的仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法。

二．实验器材与试剂

1. 主要仪器

高压蒸汽灭菌器；超净台；电热干燥箱；自动双重纯水蒸馏器；CO2培养箱；电热恒温培养箱；液氮罐；低温冰箱；超低温冰箱；倒置显微镜（Olympus，Japan）； 100ml的玻璃培养瓶；6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）；Eppendroff管；1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；5ml冻存管；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿；解剖器械；离心机；漏斗和量筒；培养皿；酒精灯等。

2.主要试剂及配制

⑴ MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液

①低糖DMEM母液

用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水；

将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。

每升培养基中添加3.7gNaHCO3。

搅拌直至完全溶解。

用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。

立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。

②MEF培养液

取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。PBS缓冲溶液

⑵ PPS------含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液的配置

在500ml超纯水中依次溶入

NaCl 4.0g

KCl 0.1g

Na2HPO4.12HO2 1.445g

KH2PO4 0.1g

于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。

⑶ 0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA混合消化液的配置

在100ml超纯水中分别溶解

胰蛋白酶干粉(Trypsin, Sigma,T4799) 0.25g

EDTA 0.02g

NaCl 0.7g

Na

2HPO

4

.12H

2

O 0.024g

KH

2PO

4

0.024g

KCl 0.037g

Tris 0.3g

D-葡萄糖0.1g

酚红1mg

于4℃过夜，使之充分溶解，用1mol/lHCl调PH至7.6, 0.22um的滤器过滤除菌，在–10～30℃下冻存备用。

⑷0.1%的明胶水溶液

称明胶0.1g （Sigma, G—9391）溶于100ml超纯水中，先加热溶解，再分装入20ml的血清瓶中于121℃高压灭菌45min，于4℃保存。

⑸ 10ug/ml的丝裂霉素C工作液----刺激成纤维细胞生长的物质

三．0.5mg/ml的丝裂霉素C母液

在盛有2mg丝裂霉素C的小瓶中加入4ml高压灭菌的PBS，用高压灭菌的尖嘴混匀。即得0.5mg/ml的丝裂霉素C母液。

注：此步应在胶卷暗盒内操作，然后于4℃避光保存。

② 10ug/ml的丝裂霉素C工作液

在24.5ml的MEF培养液中加入0.5ml的0.5mg/ml的丝裂霉素C母液，并经0.22um的滤器过滤至25ml血清瓶中。用前临时配制，并在37℃的CO2培养箱中预温30min.。

⑹冻存液

取2支1.5ml Eppendroff管，每管均加入0.9ml DMEM（低糖型）培养液和0.1ml二甲基亚砜（DMSO，AR纯，中国医药集团上海化学试剂公司），置40C冰箱中预冷60min。

3.动物

性成熟期即大于8周龄昆明种小白鼠，领自福建医科大学实验动物中心。

三．实验步骤

⑴获取小鼠胚胎

将8周龄的♀鼠和12周龄的♂鼠按1:1比例合笼。

次日晨10:00前观察♀鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天。

实验时断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。

75％酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。

用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。

用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。

将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。

在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。

将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。

将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。

将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。

⑵小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块培养法）

将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块（需剪约200下）。

用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。