重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
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生物技术大实验—实验五 重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
概述 实验仪器设备 实验试剂 操作步骤 重组质粒的转化 阳性克隆的鉴定与筛选 注意事项
一,概述Fra Baidu bibliotek
(一)重组DNA的转化
要使外源基因得到正确表达,必须把目的 基因或重组DNA分子引入受体细胞.受体细 胞可以是原核细胞,也可是真核细胞,其所 选择的受体细胞根据目的而定,原核中多用 大肠杆菌.
(2)酶切鉴定重组质粒
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于 含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基 中,37℃下振荡培养12小时.使用煮沸 法快速分离质粒DNA直接电泳,同时 以煮沸法抽提的pBS质粒做对照,有插 入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS 慢.再用与连接未端相对应的限制性 内切酶进一步进行酶切检验.还可用 杂交法筛选重组质粒.
把以质粒为载体的重组DNA分子引 入受体细胞的过程叫做转化 (Transformation);把以噬菌体或病 毒为载体的重组DNA引入受体细胞的过 程叫做转染(Transfection).对细菌细 胞进行转化或转染的关键是细胞处于感 受态.
(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体 的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应 的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进 行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外 源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水 中,定容至100ml,高压灭菌. 6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取 0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至 100ml,高压灭菌.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素 时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带 插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选 效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色 菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表 达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质 粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.
⑴ 重组质粒的筛选 1,每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均 匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直 至液体被完全吸收. 2,倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明 显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板. 3,放于4℃数小时,使显色完全(此步麦康凯培养 基不做). 不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性, 不能在含有Amp的筛选培养基上成活.带有pBS载 体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯 筛选培养基上呈现为红色菌落.在X-gal和ITPG培 养基上为蓝色菌落.带有重组质粒转化子由于丧失 了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和xgal和ITPG培养基上均为白色菌落.
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阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以 利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组 子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大 小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子 中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的 基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因 的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合 到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基 因也可能正确表达.
二,实验仪器设备 恒温摇床,台式高速离心机,恒温 水浴锅, 琼脂糖凝胶电泳装置, 电热恒温培养箱,电泳仪,无菌工 作台, 微量移液枪,eppendorf管. 低温冰箱, 制冰机, 分光光度计
三,实验试剂
1.LB固体和液体培养基 2.Amp母液 3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体 培养基高压灭 菌后冷却至60℃左右,加入 Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺 板. 4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦 康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全 溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp 储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其 解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超 过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速 置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平 板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水 代替DNA溶液,其它操作与上面相同. 此组正常情况下在含抗生素的LB平板 上应没有菌落出现. 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水 代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液 涂布于不含抗生素的LB平板上,此组 正常情况下应产生大量菌落.
(二)重组质粒的筛选
概述 实验仪器设备 实验试剂 操作步骤 重组质粒的转化 阳性克隆的鉴定与筛选 注意事项
一,概述Fra Baidu bibliotek
(一)重组DNA的转化
要使外源基因得到正确表达,必须把目的 基因或重组DNA分子引入受体细胞.受体细 胞可以是原核细胞,也可是真核细胞,其所 选择的受体细胞根据目的而定,原核中多用 大肠杆菌.
(2)酶切鉴定重组质粒
用无菌牙签挑取白色单菌落接种于 含Amp 50μg/ml的 5ml LB液体培养基 中,37℃下振荡培养12小时.使用煮沸 法快速分离质粒DNA直接电泳,同时 以煮沸法抽提的pBS质粒做对照,有插 入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS 慢.再用与连接未端相对应的限制性 内切酶进一步进行酶切检验.还可用 杂交法筛选重组质粒.
把以质粒为载体的重组DNA分子引 入受体细胞的过程叫做转化 (Transformation);把以噬菌体或病 毒为载体的重组DNA引入受体细胞的过 程叫做转染(Transfection).对细菌细 胞进行转化或转染的关键是细胞处于感 受态.
(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体 的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应 的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进 行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外 源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
5.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水 中,定容至100ml,高压灭菌. 6.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取 0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至 100ml,高压灭菌.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素 时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带 插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选 效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色 菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表 达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质 粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.
⑴ 重组质粒的筛选 1,每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均 匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直 至液体被完全吸收. 2,倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明 显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板. 3,放于4℃数小时,使显色完全(此步麦康凯培养 基不做). 不带有pBS质粒DNA的细胞,由于无Amp抗性, 不能在含有Amp的筛选培养基上成活.带有pBS载 体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯 筛选培养基上呈现为红色菌落.在X-gal和ITPG培 养基上为蓝色菌落.带有重组质粒转化子由于丧失 了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和xgal和ITPG培养基上均为白色菌落.
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阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以 利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组 子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大 小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子 中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的 基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因 的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合 到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基 因也可能正确表达.
二,实验仪器设备 恒温摇床,台式高速离心机,恒温 水浴锅, 琼脂糖凝胶电泳装置, 电热恒温培养箱,电泳仪,无菌工 作台, 微量移液枪,eppendorf管. 低温冰箱, 制冰机, 分光光度计
三,实验试剂
1.LB固体和液体培养基 2.Amp母液 3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体 培养基高压灭 菌后冷却至60℃左右,加入 Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺 板. 4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取52g麦 康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全 溶解,高压灭菌,待冷至60℃左右加入Amp 储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其 解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超 过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速 置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平 板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水 代替DNA溶液,其它操作与上面相同. 此组正常情况下在含抗生素的LB平板 上应没有菌落出现. 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水 代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液 涂布于不含抗生素的LB平板上,此组 正常情况下应产生大量菌落.
(二)重组质粒的筛选