乙酰胆碱对试验性结肠炎中移动抑制因子活性的影响

ｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＧＳＨｐｘ） ｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｕｓｉｎｇｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＴＳＧ ｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０１～１００μｍｏｌ· Ｌ－１ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄｎｏａｐ ｐａｒｅｎｔｃｙｔｏｔｏｘｏｃｉｔｙ．１０μｍｏｌ· Ｌ－１ ａｎｄ１００μｍｏｌ· Ｌ－１ ＴＳＧ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＶＳＭＣｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｅｒｕｍ，ｃｅｌｌｃｙｃｌｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｆｒｏｍ Ｇ０／Ｇ１ｐｈａｓｅｔｏＳｐｈａｓｅ，ＰＣＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｎｕｃｌｅｕｓ ｏｆＶＳＭＣｓａｎｄｌｅｖｅｌｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＲＯＳ．１００μｍｏｌ· Ｌ－１ ＴＳＧｍａｒｋｅｄｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＳＯＤ ａｎｄ
１．６ 神经递质和抗体预处理 １．６．１ 阿托品和 ＭＩＦ抗体的体内干预实验 阿托 品使用剂量参考文献［７］，从实验 ｄ１开始，在每次给 动物致敏或结肠灌注 ＤＮＣＢ前 １５ｍｉｎ，腹腔注射阿 托品（２μｌ·ｇ－１体重），对照组注射双蒸水。ＭＩＦ抗 体浓度及用量按文献［８－９］，以 ＰＢＳ倍比稀释至 １∶ ５、１∶１０和 １∶２０，在每次 ＤＮＣＢ灌肠前 １０ｍｉｎ，按 ２ μｌ·ｇ－１体重结肠灌注。 １．６．２ 乙酰胆碱和 ＭＩＦ抗体的离体干预实验 在 制备 ＭＩＦ的过程中，于脾细胞培养中分别加入 ＡＣｈ （１×１０－７、１×１０－５和 １×１０－３ ｍｏｌ·Ｌ－１）或 ＭＩＦ抗 体（１∶４００、１∶２００和 １∶１００），相应的对照组分别 加入溶剂或 ＩｇＧ。 １．７ 统 计 学 处 理 实 验 数 据 以 ｘ珋±ｓ表 示，以 ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４０和 ＳＰＳＳ１１５软件绘图并做 ｔ检 验和方差分析（ＡＮＯＶＡ）。 ２ 结果 ２．１ ＤＮＣＢ引起小鼠结肠炎并升高 ＭＩＦ的活性 ＤＮＣＢ灌肠引起的小鼠 ＤＡＩ评分、结肠大体病理与 我们 以 前 的 结 果 基 本 相 同 。 ［１－２，５］ Ｆｉｇ１显 示：随 ＤＮＣＢ灌肠液浓 度 增 大，小 鼠 结 肠 的 镜 下 组 织 学 改 变逐渐加重；Ｔａｂ１和 Ｆｉｇ４显示，ＤＮＣＢ引起结肠炎 时，ＭＩＦ的释放活性明显增加，以 １９７ｍｍｏｌ· Ｌ－１ ＤＮＣＢ组最明显。Ｆｉｇ２Ｂ、２Ｃ表明：ＤＮＣＢ引起结肠 炎时，肠组织 ＭＩＦ蛋白的表达活性明显增强。ＭＩＦ 抗体灌肠预处理则可减轻 ＤＮＣＢ肠炎的病理改变并 降低 ＭＩＦ的活性（Ｔａｂ１，Ｆｉｇ２Ｄ）。
中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ３２２．４５；Ｒ３６３３３２；Ｒ５７４．６２０．２２； Ｒ９７１．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－１９７８（２０１０）０７－０９３９－０５ 摘要：目的 探讨副交感神经在实验性结肠炎中的作用，特 别是乙酰胆 碱 （ＡＣｈ）对 结 肠 炎 中 移 动 抑 制 因 子 （ＭＩＦ）活 性 的影响。方法 以 二 硝 基 氯 苯 （ＤＮＣＢ）灌 注 小 鼠 结 肠 制 备 结肠炎模型，以免疫荧光染色法测定结肠组织和肠神经元中 ＭＩＦ蛋白的表达，以二苯基四氮唑溴盐（ＭＴＴ）法测定脾淋巴 细胞中 ＭＩＦ的释放。观察腹腔注射（预处理）阿托品或 ＭＩＦ 抗体、以及体外 ＡＣｈ干预细胞培养，对结肠炎病理、ＭＩＦ表 达及释放的影响。结果 结肠炎小鼠肠组织和肠壁神经元 ＭＩＦ蛋白的表达、淋巴细胞中 ＭＩＦ的释放均随 ＤＮＣＢ灌肠液 浓度的增大而增多，ＭＩＦ抗体（１∶５）或阿托品（１μｇ·ｇ－１体 重）预处理可减轻 ＤＮＣＢ引起的肠病理改变及 ＭＩＦ的表达 和释放。ＡＣｈ（１０－７ｍｏｌ·Ｌ－１ ～１０－３ ｍｏｌ·Ｌ－１）可增加淋巴 细胞中 ＭＩＦ的释放，该作用可被阿托品（１０－５ ｍｏｌ·Ｌ－１）共 同孵育而阻断（阿托品组与 ＡＣｈ１０－５ ｍｏｌ·Ｌ－１和 １０－３ ｍｏｌ ·Ｌ－１组相比，Ｐ＜００５，Ｐ＜００１）。结论 在 ＤＮＣＢ引起小 鼠结肠炎过程中，内源性 ＡＣｈ的活动增强可能是加重结肠 病理和升高炎症因子 ＭＩＦ活性的原因之一。
Ｆｉｇ１ Ｔｈｅｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｍｏｕｓｅｃｏｌｏｎ ｂｙＤＮＣＢｅｎｅｍａ（ＨＥ，×１００）
Ａ：Ｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎ０５０ｅｔｈａｎｏｌ，ｂａｓｉｃａｌｌｙｎｏｒｍａｌｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒｕｃ ｔｕｒｅ；Ｂ：９８ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＤＮＣＢ，ｄｅｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｇｌａｎｄ；Ｃ：１９７ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＤＮＣＢ，ｅｒｏｓｉｏｎ
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中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１０Ｊｕｌ；２６（７）
０１６ｍｏｌ·Ｌ－１；ＤＮＣＢ灌肠液以体积分数为 ０５０的 乙醇配制，终浓度分别为 １９７、９８和 ４９ｍｍｏｌ· Ｌ－１。 １．２．２ 硫酸阿托品溶液 以双蒸水稀释硫酸阿托 品注射液，终浓度为 ０５ｇ·Ｌ－１，２～８℃保存备用。 １．２．３ 氯化乙酰胆碱溶液 以双蒸水配制氯化乙 酰胆碱，终浓度为 ０１ｍｏｌ·Ｌ－１，－２０℃避光保存。 １．２．４ 抗体及其他工作液 所有一抗、二抗及对照 用 ＩｇＧ均以质量浓度为 １ｇ·Ｌ－１的 ＢＳＡ稀释。ＲＰ ＭＩ１６４０培养液、红细胞裂解液、植物血凝素（ＰＨＡ） 等，均按已有方法进行操作［１］。 １．３ 小鼠结肠炎模型及评价 按已有方法 制 ［１－２］ 备结肠炎模型，简述如下：ｄ１将小鼠随机分为对照 和实验组后，以 ＤＮＣＢ涂腹液给小鼠涂腹致敏，每天 １次，每次 ５０μｌ，连续 ４ｄ。ｄ５分别以 ３个浓度的 ＤＮＣＢ灌肠液给小鼠灌肠，每天 １次，每次 ２μｌ· ｇ－１体重，连续 ４ｄ。对照组小鼠的涂腹液相同、但灌 肠液为等量的、体积分数 ０５０的乙醇。自灌肠后， 每日记录小鼠全身状态、体重和大便性状，用于 ＤＡＩ 评分［１，５］。ｄ９，将动物颈部脱臼处死，取结肠先行大 体病理观察，然后取病变明显处（插管尖端上下约 ５ ｃｍ）的结肠，置体积分数 ０１０的甲醛中固定，常规 石蜡包埋、切片 ５μｍ、ＨＥ染色，镜下观察结肠组织 学改变、并以此切片做 ＭＩＦ蛋白的免疫荧光染色。 同时取小鼠脾淋巴细胞，测定其 ＭＩＦ的释放活性。 １．４ ＭＩＦ蛋 白 免 疫 荧 光 染 色 参 照 已 有 方 法［２］， 将小鼠结肠石蜡切片（５μｍ）进行脱蜡、水化、抗原 修复和封闭非特异结合等处理。免疫荧光单染时， 将 ＭＩＦ一抗滴于玻片标本上，置 ４℃湿盒 １２ｈ，取出 后置 室 温 １ｈ，以 ＰＢＳ洗 去 未 结 合 成 分，再 滴 加 ＴＲＩＴＣ标记的二抗，室温避光孵育 １ｈ，在 ＯＬＹＭＰＵＳ ＵＲＦＬＴ５０荧光显微镜（日本）下检测 ＭＩＦ蛋白的荧 光强度并照像。免疫荧光双染步骤与单染基本相 同，但需同时滴加 ＭＩＦ一抗和 ＭＡＰ２一抗、并同时滴 加 ＴＲＩＴＣ标记和 ＦＩＴＣ标记的二抗。一抗和二抗的 工作浓度均为 １∶３００。 １．５ ＭＩＦ释 放 活 性 的 测 定 以 细 胞 的 吸 光 度 （Ａ Ｖａｌｕｅ）代表 ＭＩＦ的释放活性，其原理和方法详见我 们以前的报道［１，６］，简述如下：实验 ｄ９取结肠的同 时，取脾淋巴细胞制备内含 ＭＩＦ的工作液，以豚鼠 外周血白细胞作为指示细胞，采用 ＭＴＴ法测定 ＭＩＦ 工作液对指示细胞从毛细管中移出量的影响，细胞 移出 数 量 多，酶 标 仪 （ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ Ｒｅａｄｅｒ，波 长 ５７０ｎｍ）测得的 Ａ值则越大，说明 ＭＩＦ的释放活性 越低，反之亦然［６］。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
我们前一工作表明：２，４—二硝基氯苯（２，４ｄｉ ｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ，ＤＮＣＢ）引 起 的 实 验 性 结 肠 炎 过 程中，神经免疫 介 导 物 移 动 抑 制 因 子 （ＭＩＦ）的 释 放 活性 明 显 升 高［１］，腹 腔 注 射 ６羟 基 多 巴 可 加 重 ＤＮＣＢ引起的结肠炎、并进一步升高 ＭＩＦ活性［２］，提 示肠交感神经的正常活动在维持肠功能稳态中起重 要作用。胃肠受交感和副交感神经的双重支配，关 于副交感神经对结肠炎有何影响，文献报道不尽一 致，有报道［３］损 伤 小 鼠 迷 走 神 经 功 能 后，由 磺 琥 辛 酯钠（ＤＳＳ）所致的结肠炎加重，也有报道激活迷走 神经后不利于抑制感染性肠炎的发展，并增加动物 的死亡率［４］。对于 ＤＮＣＢ引起的结肠炎，副交感神 经有何作用，特别是副交感神经的主要递质 ＡＣｈ对 ＭＩＦ有何作用，尚未见报道，本文将以 ＤＮＣＢ引起的 小鼠结肠炎模型进行这方面的探讨。 １ 材料与方法 １．１ 实 验 动 物 清 洁 级 ♂ ＢＡＬＢ／ｃ小 鼠 ［证 书： ＳＣＸＫ（京）２００７－０００１］，７～９ｗｋ，体质量 １８～２２ｇ， 购于北京大学医学部实验动物科学部。 １．２ 试剂及溶液配制 ＤＮＣＢ购于北京化学试剂 公司；硫酸阿托品购于上海禾丰制药有限公司；氯化 乙酰胆碱购于 Ｓｉｇｍａ公司；兔抗 ＭＩＦ多克隆抗体和 鼠抗神经元微管相关蛋白 ２（ＭＡＰ２）单克隆抗体均 购自 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；荧光素罗丹明（ＴＲＩＴＣ）标记 的山羊抗兔 ＩｇＧ和异硫氰酸（ＦＩＴＣ）标记的山羊抗 小鼠 ＩｇＧ均购于 Ｊａｃｋｓｏｎ公司。 １．２．１ ＤＮＣＢ溶液 方法同前［１］，简述如下：ＤＮＣＢ 涂腹液以丙 酮：橄 榄 油 （１∶１）混 合 液 配 制，终 浓 度
ＧＳＨｐｘ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ＣｅｒｔａｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＴＳＧ ｃａｎｐｒｅｖｅｎｔＶＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｓｅ ｒｕｍ；ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍａｂｏｕｔＴＳＧｅｆｆｅｃｔｍａｙｂｅａｓｓｏｃｉａｔ ｅｄｗｉｔｈａｒｒｅｓｔｉｎｇＧ０／Ｇ１ ｔｏＳｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ＰＣＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆ ＶＳＭＣｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：２，３，４′，５ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂｅｎｅ２ＯβＤ ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ；ｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ； ｃｅｌｌｃｙｃｌｅ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇｃｅｌｌｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｇｅｎ；ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ
中国药理学通报 ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎ ２０１０Ｊｕｌ；２６（７）：９３９～４３
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乙酰胆碱对实验性结肠炎中移动抑制因子活性的影响
纪黎黎１，林 萍２，潘 慧１，梅 林１
（１．北京大学医学部生理学与病理生理学系，北京 １００１９１；２．湖北民族学院医学院生理学教研室，湖北 恩施 ４４５０００）
２．２ 乙酰胆碱对结肠炎中 ＭＩＦ活性的影响 ２．２．１ 腹腔注射阿托品对结肠炎的 ＭＩＦ表达活性 的影响 阿托品（１μｇ·ｇ－１体重，ｉｐ）预处理，可减弱 结肠炎小鼠肠组织 ＭＩＦ蛋白的表达。免疫荧光双 染 显 示 ：肠 壁 神 经 元 中 ＭＩＦ蛋 白 的 表 达 （棕 色 荧 光
关键词：结肠炎；肠神经系统；乙酰胆碱；毒蕈碱受体；移动抑 制因子；二硝基氯苯；小鼠
收稿日期：２０１０－０２－２５，修回日期：２０１０－０４－２６ 基金项目：北京市自然科学基金资助项目（Ｎｏ７０６３０８３） 作者简介：纪黎黎（１９８３－ ），女，硕士，研究方向：神经内分泌与代
谢，Ｔｅｌ：０１０８２８０１４１８，Ｅｍａｉｌ：ｊｉｌｉｌｉ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ； 梅 林（１９５６－ ），女，博士，教授，硕士生导师，研究方向： 消化道神经 免 疫 调 节，通 讯 作 者，Ｔｅｌ：０１０８２８０１４７７，Ｆａｘ： ０１０８２８０１４７７，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｎｍｅｉ＠ｂｊｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ