免疫组织化学及其在病理诊断中的应用

3、免疫酶技术中常用的标记酶
① 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）－－最常有 ② 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）
常用方法



酶桥法：相当于间接法，将酶标于二抗 （抗酶抗体）上。桥→二抗 PAP法：HRP抗HRP复合物， 双PAP法等。
免疫组化的优点




特异性强：抗原和抗体呈现一对一特异 结合。交叉抗原→交叉反应 敏感性高：更敏感方法的出现，如SP法 等，临床应用更方便 定位准确：形态与功能相结合，便于深 入研究 设备少，操作简单、易行
免疫组化室常用小设备

冰箱(4℃ 、-18 ℃)；贮存免疫组化试剂用。 高压锅，电炉(1000-1500W)或微波炉(700-800 瓦)(抗原修复用，可任选一种)，1000ml烧杯； 孵育盒、塑料耐高温切片架； 冲洗瓶、定时器、塑料试管、5-10ml玻璃试管 等； 100μl 、200 μl 、20 μl 可调微量移液器 各1支；相应的吸嘴。 磨砂玻片； 空调1台； 恒温箱1台； pH计1台(PHS-25型)。
免疫组化室常用设备
全自Hale Waihona Puke Baidu免疫组化染色机
二、免疫酶标技术
20世纪70年代建立
80年代为发展高峰
90年代在国、内外病理科广泛应用
1.免疫酶标技术原理：


将抗原和抗体反应与酶的催化反应相结合 而建立的一种免疫检测技术。 先用结合剂（戊二醛）将酶结合在抗体分 子的氨基或羟基上而形成酶标记抗体。 然后和相应抗原反应，使抗原抗体复合物 上带有酶分子，再借酶对底物的特异催化 作用，生成有色的不溶性产物或有一定电 子密度的颗粒，在光镜或电镜下进行细胞 表面及细胞内各种抗原成分的定位。
免疫组织化学及其 在临床病理中的应用
第一部分
免疫组织化学技术及其原理
一、概

述
免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）： 利用抗原抗体特异性结合的特点， 通过化学反应，使标记于抗体上的显色 剂（酶、金属离子、荧光素）显示出一 种颜色，借助电子、荧光或普通显微镜 观察其颜色变化，从而在抗原结合部位 确定组织细胞某种成分的方法。
三、亲和免疫细胞化学技术


出现于70年代。 使免疫细胞化学敏感性进一步提高。 特点：以一种物质对某种组织成分具有高度亲 和力为基础，本质上不是抗原抗体反 应。 1976年Bayer将其称之为亲和组织 化学（affinity histochemistry）。 抗原抗体反应本质上属于亲和组织化学 包括：抗原与抗体； 植物凝集素与糖类； 生物素与抗生物素； 葡萄球菌A蛋白与IgG等
分 类
根据实验中标记物的种类和检测方法不同， 免疫标记技术分为： 免疫荧光技术 放射免疫技术 免疫酶标技术 免疫电镜技术 免疫胶体金技术 亲和免疫技术 免疫铁蛋白技术
发展过程



1941年：建立免疫荧光技术；20世纪50 年代末开始推广使用； 1956年：建立了放射免疫检测； 1966年：发现酶可作为底物，并于20世 纪70年代初建立酶标免疫技术，之后发 展迅速； 1976年：亲和组织化学（affinity histochemistry）。
2.标记酶的要求
凡对抗体无毒性又具有高催化效率的酶，理论上 均可标记抗体。 1）酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，可 在光镜和电镜下观察。 2）所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周围弥散。 3）中性PH值时酶应稳定，酶标记后活性不改变。 4）被检组织内最好不存在与标记酶相同的内源酶。
5）酶的相应底物易于制备和保存，价格低廉，酶分 子量不能太大，有商品出售。
用生物素二抗与第一抗体结合，再与ABC 复合物联结形成抗原－抗体－生物素二抗－ ABC。最后用底物显色剂显色。
5、SP法（链霉菌抗生物素卵蛋白－过氧化物酶 连结法, Streptavidin-Peroxidase, SP ）
国外其他公司亦将此法注册为 LSAB法，LAB －SA法和SABC法等
1.基本原理



维生素H（biotin，生物素）缺乏症：给动 物喂养大量卵蛋白，会导致动物出现维生 素H缺乏症，即蛋白质伤害。 卵蛋白（avidin）与生物素有极高的亲和力， 且具有与其它示踪物质（荧光素、铁蛋白、 过氧化酶等）相结合的能力。 其亲和力较抗原抗体高出100万倍。 细胞免疫+亲和组织化学＝亲和免疫细胞 化学
二抗
一抗 抗原 直接法 间接法
酶
3、PAP法
用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结 合，又与PAP复合物联结，最后用底物显色剂显 色。
4、ABC法：卵白素－生物素－过氧化物酶连 结法（avidin biotin-peroxidase complex technique, ABC） 利用卵白素（avidin）与生物素（Biotin）特 有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与 辣根过氧化物酶（HRP）结合，形成生物素化HRP， 然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。
四、免疫组化常用方法
1、直接法－将酶直接标记在一抗 2、间接法－将酶标记在二抗，常用 3、PAP法、ABC法－复合物 4、SP法 5、多重免疫组化染色法
1、直接法（酶标记）
将酶（以HRP为例）标记在特异抗体上，然 后用酶标抗体直接与相应抗原特异结合。形成抗 原－抗体－酶复合物，最后用底物显色剂显色。 2、间接法 将酶标记在第二抗体上，先将一抗（特异性 抗体）与相应的抗原结合，形成抗原抗体复合物， 再用二抗（酶标记抗体）与复合物中的特异抗体 结合，形成抗原－抗体－酶标抗体复合物，最后 用底物显色剂显色。
2.常用方法



ABC：抗生物素－卵白素－过氧化酶复合 物技术（avidin biotin-peroxidase complex technique, ABC） SABC：链霉亲和素－生物素－酶复合 物（strept avidin-biotin complex，SABC） Envision：多聚鳌合物标记的二抗 S-P：链霉卵蛋白－过氧化物酶 （Streptavidin–Peroxidase，SP）