沙地葡萄茎痘相关病毒PCR检测及外壳蛋白基因变异分析

沙地葡萄茎痘相关病毒PCR检测及外壳蛋白基因变异分析

沙地葡萄茎痘病(Grapevine rupestris stem pitting, GRSP)是嫁接传染性病害,为皱木复合病(Rugose wood complex disease)中最为普遍的一种,在栽培品种中一般潜伏侵染。以沙地葡萄圣乔治(Vitis rupestris cv. St. George)为砧木时,嫁接口以下剥去树皮可见木质部有星状穴和条状槽沟,会造成嫁接口部位逐渐坏死,植株长势衰弱,树体矮小等。

沙地葡萄茎痘相关病毒(Grapevine rupestris stem pitting associated virus, GRSPaV)与GRSP有关,该病毒隶属凹陷病毒属(Foveavirus),基因组大小为8.4～9.3kbp,为正义单链RNA病毒,编码五个开放阅读框(Open reading frame.ORF),含一个Poly(A); ORF1编码病毒复制酶蛋白(RP), ORF2～ORF4组成一个三基因框(Triple-gene block,TGB),编码TGBpl-p3, ORF5编码外壳蛋白(CP)。多样性分析表明,GRSPaV的序列多变,目前存在10个不同的序列变异体。

为调查我国沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)侵染状况以及不同分离株外壳蛋白(coat protein, CP)基因变异情况,并为今后该病毒的致病性、病害的防控及抗病毒转基因工程等研究提供依据,本研究对采自我国16个省市自治区的葡萄样品中的GRSPaV进行RT-PCI检测,选择部分样品进行了印基因的克隆与测序分析,并对三种不同RNA提取方法进行了比较,主要取得了以下研究结果：1、比较研究了CTAB法、SDS法以及SiO2吸附法的提取效果,结果显示,SDS法提取的RNA条带不清晰,有拖尾现象,此外,在核酸溶解的过程中,该方法得到的RNA黏性大,杂质较多,呈褐色；CTAB法提取的RNA在电泳图上无任何条带；SiO2吸附法提取的RNA,28S和18S条带完整且清晰,溶于水后无杂质,表明所提RNA质量较好,可用于后续研究。2、对我国16个省市自治区的65个葡萄品种305株葡萄样品

进行RT-PCR的检测结果显示,除新疆的样品外,其余15个地区的葡萄中均检测到GRSPaV。

有114株样品带毒,平均带毒株率为37.4%。对检测结果进行分析发现,不同地区的葡萄品种带毒情况不同,品种带毒率最高的为88.9%,最低的为20.0%；不同地区的葡萄植株带毒情况也存在差别,葡萄植株带毒率最高的为75.0%,最低的为6.7%。

3、通过对不同时期、不同部位的葡萄样品中的GRSPa(?)进行检测,结果显示,五月份采取的样品中,只在叶柄处检测到病毒；在八月份的样品中,分别在卷须、叶柄以及果实中检测到病毒。综合重复试验得出以下结论：对于GRSPaV的检测,春季的最佳部位为叶柄,而秋季可采用卷须、叶柄或果实,其中,果实的检测结果最好。

4、本研究共克隆了来自10个省市的27个葡萄品种41个样品,与来自六个国家的12个分离物的CP序列进行序列比对分析,其核苷酸序列同源性为

80.4%～99.7%,氨基酸序列同源性为81.9%～100%。所有的分离物在系统发育树上聚为三个大组(组Ⅰ、组Ⅱ和组Ⅲ)。

各个分离物间的遗传距离无明显的地域以及品种差异,此外,以氨基酸序列和核苷酸序列构建的系统发育树基本一致。部分分离物内各个克隆间的同源性差异较大,表明植株存在不同序列变异体的复合侵染。

此外,同一分离物内部不同克隆的SSCP以及RFLP研究,两者的分型结果基本一致。