核酸化学(翻译)

成纤维生长因子-21通过激活AMPK–SIRT1–PGC-1α信号通路调节能量代谢

成纤维细胞生长因子-21已经被证实是一种潜在的代谢调节因子。对经饮食诱导或遗传的肥胖的糖尿病啮齿类和恒河猴施用重组成纤维细胞生长因子-21后，其表现出了很强的抗高血糖和降低甘油三酯并减轻体重的作用。尽管成纤维细胞生长因子-21在调节葡萄糖、脂质和能量平衡中发挥了重要的作用，但是成纤维细胞生长因子作为一种代谢调节因子的作用机制仍然不是很清楚。本实验证明了，成纤维细胞生长因子-21是通过激活AMP激活蛋白激酶(AMPK)和SIRT1，从而增强了线粒体的氧化能力，对脂肪组织细胞进行能量平衡的调节的。FGF-21作用于来自OB/OB小鼠的脂肪细胞和白色脂肪组织都增强了AMPK的磷酸化水平。FGF-21的应用增强了细胞内的NAD+水平，从而激活了SIRT1及对其下游的靶位点进行了脱乙酰基作用，过氧化物酶体增殖子激活受体-γ辅助因子-1α (PGC-1α)和第3位组氨酸。FGF-21作用脂肪细胞后激活了AMPK和SIRT1，进而增强了线粒体氧化能力，表现为耗氧量、柠檬酸合成酶的活性的增加，以及诱导关键代谢基因的转录与表达。FGF-21增强线粒体功能的能力需要丝氨酸-苏氨酸激酶11 (STK11/LKB1)，STK11/LKB1可以激活AMPK .抑制了AMPK,SIRT1和PGC- 1α的活性，FGF-21对氧耗和基因表达的影响降低了，这表明FGF-21的调节线粒体功能和增加氧化能力是通过依赖AMPK–SIRT1–PGC1α信号通路的这一机制在脂肪细胞细胞中实现的。

AMP激活蛋白激酶（AMPK）是一个主要能量代谢效应器和主要的代谢平衡的调节因子。LKB1，一种丝苏氨酸激酶，是激活AMPK的主要调节因子。LKB1直接对AMPK的第172位的苏氨酸进行磷酸化进而激活AMPK激酶的活力。LKB1的表达是由运动诱导的，它作为肝脏中葡萄糖生成的关键介质之一。最近，AMPK被指出，其在治疗二型糖尿病及代谢综合症的基本疗法中，如二甲双胍、噻唑啉二酮类、运动等发挥了重要作用。AMPK的激活，开启了分解代谢通路，增强氧化代谢和线粒体的生物合成，从而维持了能量平衡。最近，AMPK被发现通过增加细胞内NAD+ 水平来增强NAD+依赖的三型脱乙酰化酶SIRT1的活性，从而调节SIRT1下游靶位点的基因的活性。

SIRT1在哺乳动物调节代谢功能和延长寿命中起到了重要作用。SIRT1的激活同样利于营养物质的选择性利用和通过增强线粒体氧化功能调节能量平衡。AMPK 和SIRT1通过协同作用，对线粒体生物合成，PGC-1α进行调节，从而调节机体对环境和营养的刺激后的能量平衡。PGC-1α通过与多种转录因子相互作用来刺激线粒体的代谢调节能力。

成纤维细胞生长因子-21已经被证实是一种潜在的代谢调节因子。对经饮食诱导或遗传的肥胖的糖尿病啮齿类和恒河猴施用重组成纤维细胞生长因子-21后，其表现出了很强的抗高血糖和降低甘油三酯并减轻体重的作用。最近研究表明，β-klotho,是一种与klotho相似的单次跨膜蛋白，最为一种FGF-21的信号的辅助受体因子来发挥其作用。由于β-klotho在FGF-21信号中，作为一种关键的辅助因子，所以它的表达使得FGF-21仅在肝脏、胰脏和脂肪细胞组织中特异性表达，因为β-klotho主要在这些部位表达。

最近，FGF-21在肝脏中的作用已被证实，FGF-21在饥饿中对能量平衡起到了重要的调节作用。FGF-21可通过禁食诱导表达。在禁食中，肝脏中脂肪氧化、甘油三酯的清除及生

酮代谢中，都需要FGF-21的存在。尽管，FGF-21在肝脏代谢调节中起到了重要的作用，但是我们对于其在脂肪组织中所起到的作用还知道的很少。此外，FGF-21在调节葡萄糖和能力平衡中的作用机制，我们仍然不清楚。

这里我们证明了FGF-21是在脂肪细胞中，通过LKB1激活来调节AMPK和SIRT1的活性来调节能量消耗的。FGF-21改变了细胞内NAD+的水平，导致SIRT1的激活，其下游靶基因的脱乙酰基化，即PGC-1α and histone 3 (H3)。这些关键代谢效应器的激活，导致了线粒体氧化功能的增加，从而阐明了FGF-21在代谢调节中的作用。

结果

FGF-21增强了AMPK 的活性为了深入研究FGF-21调节能量消耗的作用机制，我们用FGF-21 (4.0 μg/mL)处理3T3-L1细胞3天，通过Western blot来分析被激活的AMPK的水平。FGF-21的作用，使磷酸化的AMPK增加了53% (P < 0.05; n = 3),但是AMPK总蛋白(t-AMPK)的水平始终没有改变(Fig. 1A).有趣的是，FGF-21 (4.0 μg/mL for 3 d)作用于分化的人的脂肪细胞后，使得p-AMPK (P < 0.05;n = 3)有了很大的增加（58%），但是t-AMPK的水平没有改变(Fig. 1B).。对人脂肪细胞用腺病毒过表达AMPK的alpha2 亚单位的副结构域(DN-AMPK)抑制AMPK的活性，消除了FGF-21刺激P-AMPK的增加(Fig. 1B)。

Fig.1.FGF-21增强了AMPK的活性。（A和B）Western blot 和（A）用FGF21 (4.0 μg/mL)处理3天的3T3-L1细胞中P-AMPK的定量和（B）用FGF21 (4.0 μg/mL)处理3天的人的脂肪细胞中P-AMPK的定量。数据是三次单独实验的平均值。（C和D）是Western blot和在WAT中（C）p-AMPK和（D）p-ACC，空白对照组，FGF-21处理组，对照处理组中，n = 8 animals/group. *P < 0.05 (S tudent’s t test). **P < 0.01.

为了探索FGF-21在体内是否增加AMPK的活性，我们用渗透泵连续的给ob/ob小鼠灌注重组人FGF-21蛋白来两周。与以前的报告一致，FGF-21的作用导致了总体重的显著降低(Fig. S1A),这与10到14天中少量但是显著的摄食量下降伴随着发生(Fig. S1B)。身体和组织的组成测定发现，FGF-21处理后的动物体中，总的身体中的脂肪的质量和肝脏脂肪的含量都有明显的下降(Fig. S1C).我们分析对照组和FGF-21实验组老鼠体内的W A T中的P-AMPK的含量时，FGF-21实验组老鼠体内的W A T中的P-AMPK的含量增加了53%，表明增加了AMPK 的激活(Fig. 1C).这些数据说明，FGF-21通过激活AMPK来调节能量消耗。

为了确定FGF-21的作用是否不依赖于体重，我们做了对照饲养研究实验来比较对照组和FGF-21处理组的体重。与之前的研究一致，FGF-21处理的老鼠未禁食的血糖水平被明显降低，而对照组则没有(Fig. S1D).。一个口服葡萄糖耐受实验显示，FGF-21处理后可明显提高葡萄糖的耐受(Fig. S1E)并且降低至曲线下的区域为45% (Fig. S1F).重要的是，FGF-21处理组动物的p-AMPK的水平增加了53%，但是在对照组中则没有(Fig. 1C).此外，FGF-21处理的动物的P-ACC的水平增加了（66%）,它是AMPK下游的一个靶基因(Fig. 1D).这些数据表明FGF-21可以增强细胞内AMPK的激酶的活性。这些结果说明，FGF-21对能量平衡的影响与AMPK激活是对立的改变体重的。

FGF-21增加NAD+新城代谢和SIRT1的活性现在，已经被证明，AMPK直接通过调节胞内NAD+/NADH的水平来直接激活SIRT1(8).因为FGF-21增加AMPK的活性，我们猜测FGF-21是否能改变胞内NAD+/NADH的水平。与我们的假设一致，FGF-21分别使3T3-L1细胞和人脂肪细胞中的NAD+/NADH增加了48% (P< 0.05;n = 3) 和52% (P < 0.05, n = 3) (Fig. 2 A and C).重要的是，NAD+/NADH的水平，在FGF-21处理的ob/ob的W A T中增加了40%(P < 0.05, n = 8),但是空白对照组中却没有(Fig. 2B).用DN-AMPK抑制AMPK的活性，降低了FGF-21刺激的NAD+/NADH的增加，说明FGF-21激活AMPK在SIRT1激活的上游。

为了确定FGF-21诱导的升高的NAD+/NADH是否影响SIRT1的活性，我们确定了已知的SIRT1底物的乙酰化作用模型PGC-1αand H3. 3T3-L1脂肪细胞被转染进腺病毒表达的shRNA的不含SIRT1的和腺病毒表达的一个Flag–PGC-1α结构。转染的细胞用FGF21 (4.0 μg/mL) 处理3 d。用FGF-21处理过的3T3-L1脂肪细胞PGC-1α 的乙酰化降低了28% (P < 0.05;n = 3),.shRNA敲出SIRT1 (Fig. 2D)的基因，降低了它的影响。此外，在降低H3的乙酰化水平上(68%;P < 0.05; n = 8) 经过FGF21处理的老鼠要比空白对照组明显

(Fig. 2E). 这些数据表明，在体外脂肪细胞中，FGF21 改变NAD+代谢水平并且激活了SIRT1 a的活性。总之，这些结果表明FGF-21是通过激活AMPK 和SIRT1来控制能量代谢的。

FGF-21增加线粒体基因和蛋白的表达AMPK和SIRT1都是线粒体生物合成的关键调节因子。为了检验FGF-21在线粒体生物合成和功能中的作用，我们对3T3-L1脂肪细胞进行荧光定量PCR来测定线粒体功能相关基因的表达。FGF-21处理3T3-L1脂肪细胞后，导致其CPT1a的显著增加（CPT1a是参与游离脂肪酸跨线粒体膜进行脂肪β-氧化），Idh3a增加了1.6倍（是TCA循环的限速步骤），CytC增加了(Fig. S2A).2.1倍。此外，这些基因水平