电化学发光免疫分析

电化学发光免疫分析
发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级）， 然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为: 光照发 光、生物发光、化学发光等。
电化学发光免疫分析
在化学发光反应中参与能量转移ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂 或发光底物。
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项目广泛 : 三联吡定钌NHS可与与蛋白质,
半抗原激素,核酸等各种化学物结合, 因此检测项目很广泛
例如检测小分子蛋白抗原时可采 用竞争法,检测大分子抗原时可采用 夹心法,检测抗体时可采用夹心法等
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灵敏度:<1pmol, 线性:>10000 时间:<20min
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稳定性:
钌化合物稳定性好,常温下半衰期 可达一年以上.被标记的蛋白活性在
2~5度可保持一年以上.试剂稳
定,35度可放置3周,标准曲线形态基 本保持不变
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应用 激素 病毒检测 肿瘤标志物
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第二步：
将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生 物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双 抗体夹心法。
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下一步，蠕动泵将形成的[Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合 体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。 同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体） 也被吸出测量室。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电 极加电压，启动ECL反应过程。发光剂[Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极 表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的[Ru(bpy)3]2+被氧 化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基 TPA+●，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA●， 这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的[Ru(bpy)3]3+，使其形成 激发态的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的 [Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生 成基态的[Ru(bpy)3]2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光 子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系， 故可测出待测抗原的含量。
三联吡啶钌
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原理：以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体， 在电 场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。
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以TSH为例 第一步：
结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ + N羟基琥珀 酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血 清同时加入一个反应杯中，孵育9分钟。
按检测形式分类 液相:反应经离心或分离措施后测定 固相:固定在固相载体中检测 均相:在液体中进行,不经离心或分离
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固相载体
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在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体 (抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反应体系内待测标 本与相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被 抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合 物吸入流动室，同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表 面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗 体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光 反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电 化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。
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三大经典酶免技术
发 光
酶 免
放 射
免
疫
免
疫
技
疫
技 术
术
技 术
电化学发光免疫分析
按标记物分类
化学发光免疫分析(鲁米诺) 化学发光酶免疫分析(辣根过氧化物酶,HRP) 微粒子化学发光免疫分析(二氧乙烷,磷酸脂)
电化学发光分析(三联吡啶钌)
生物发光免疫分析法(荧光素)