细胞免疫荧光

细胞免疫荧光

简单实验步骤如下:

1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.

2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟

3.PBS洗净:3min＊3

4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS

5.PBS洗净:2＊5min

6.羊血清封闭：３７度，２０分钟

７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时

８.４度PBS洗净，３min＊５次

９.二抗３７度小于一小时

１０.３７度PBS洗净，３＊５min

凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备

（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、

胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)

↓

用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为

5×10６～１×10７／ml

↓

取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)

的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS

稀释)灭活正常兔血清

↓4℃ 30min

用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右

1000rpm×5min

↓

弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠

(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇

↓4℃ 30min

用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右

1000rpm×5min

↓

加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入

1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，

视细胞浓度加入100～500μl固定液)

↓

FCM检测或制片后荧光显微镜下观察

(标本在试管中可保存5～7天)

（二）试剂和器材

1. 各种特异性单克隆抗体。

2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。

4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（三）注意事项

1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。

3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。

4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。

附:

1. DPB S (×10, 贮存液)

NaCl 80g

KCl 2g 蒸馏水加至1000ml

Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释

KH２PO４ 2g

2. 洗涤液

DPBS 900ml

FCS 50ml (终浓度5％)

4％NaN３???50ml (终浓度0.2％)

3. 固定液

DPBS 1000ml

葡萄糖20g (终浓度2％)

甲醛10ml

NaN３0.2g (终浓度0.02％)

我做的大部分细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：

1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4％冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2％Triton X－100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时（避光），或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

建议：1.还是染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。2.荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。3.二抗用之前一定离心，不然有的时候有那种沉淀，在片子上就是一个很大的非特异性荧光光点，非常难看。

直接免疫荧光法测抗原

基本原理

将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

试剂与仪器

●磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

●荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释

●缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制

●搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

●有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

●荧光显微镜

●玻片架

●滤纸

●37℃温箱等。

实验步骤

1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2.滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。

3.取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5.立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：

（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

注意事项

1.对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

3.为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。

（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

（3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4.一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

间接免疫荧光法测抗体

基本原理

染色程序分为两步，第一步，用未知未标记的抗体（待检标本）加到已知抗原标本上，在湿盒中37℃保温30min，使抗原抗体充分结合，然后洗涤，除去未结合的抗体。第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体。如果第一步发生了抗原抗体反应，标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定未知抗体。

试剂与仪器

●磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4

●缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。

●荧光标记的抗人球蛋白抗体：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释。

●搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）

●有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）

●荧光显微镜

●玻片架

●滤纸

●37℃温箱等。

实验步骤

1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10min后弃去，使标本片保持一定湿度。

2.滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

3.取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1-2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS 三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。

4.取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴一定稀释度的荧光标记的抗人球蛋白抗体。

5.将玻片平放在有盖搪瓷盒内，37℃保温30min。

6.重复操作3。