酵母菌的培养与分离

酵母菌的培养与分离
实验目的】学习培养和分离酵母菌的技术和方法
【实验原理】
大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5一6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。

【实验材料和用具】
1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。

2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：
原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。

配制方法：
（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。

（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115摄氏度条件下高压灭菌20分种。

（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸的量加入，并分装试管。

【实验步骤】
l、接种：取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28一30℃，培养24小时，可见培养液变混浊。

2、培养，用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28一30℃再培养24小时或稍长(过长则霉菌长出)。

3、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

4、分离：马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。

用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落。

挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养。

4.1.1培养基制备流程
4.1.1.1取12度生产定型(热或冷)麦汁,调整pH至
5.3-5.5,进行稀释，稀释比例以最终煮沸浓度控制在12度为准。

4.1.1.2稀释后麦汁冷却(或加热)至40℃按每升2个蛋清搅至起泡后打入。

升温至60℃保温30分钟，保温结束后升
温至100℃煮沸30分钟。

4.1.1.3检测调整浓度后过滤、分装入试管、小三角瓶、大三角瓶， 0.07Mpa灭菌30分
钟。

4.1.1.4灭菌后培养基要贴有制备日期标签，空培(室温放置)3天以上确认无菌后方可使用。

4.1.1.5卡氏罐培养基制备采用过滤后热麦汁装入清洗并经0．10Mpa蒸汽杀菌1 小时后的卡氏罐中0．10Mpa灭
菌30分钟，提前1-2天完成，确保接种温度稳定。

当天能够迅速冷却的，则取当天麦汁处理，冷却后接种。

4.1.2无菌室卫生操作流程
4.1.2.1每天对室内进行30分钟紫外杀菌。

超净台用前提前打开风机及自带的紫外灯灭菌30分钟。

4.1.2.2无菌操作前对无菌室进行全面彻底清洁。

地面、墙壁、天棚及空间采用甲醛熏蒸或75%酒精擦试。

同时用紫
外杀菌30分钟。

4.1.2.3卡氏罐接种，超净台无法操作时，室内空间当天再次进行上述空间杀菌。

4.1.2.4无菌室内应避免其他物品的摆放，尤其操净台面。

以免破坏空气层流。

4.1.2.5每次扩培时应对无菌室内空间及超净台进行两次空气捕捉检测。

斜面接出及卡氏罐接种时各进行一次。

4.1.3实验室阶段扩培工艺流程
1.安培管(或斜面菌种)在无菌条件下,接入装10ml麦汁培养液的18×180mm试管中，在25℃培养箱中活化培
养24小时(如从安培管转接,需再活化一次).
2.将活化后的试管培养液摇均,在无菌条件下,分别接1ml入装10ml麦汁培养液的
18×180mm试管中，在25℃培养箱中培养活化24小时.
3.将试管中的10ml酵母培养液转接到装50ml麦汁培养液的150ml三角瓶中, 在22℃培养箱中培养24小时.
4.将三角瓶中的50ml酵母培养液转接到装500ml麦汁培养液的1000ml三角瓶中, 在19℃培养箱中培养24小时.
5.将三角瓶中的500ml酵母培养液转接到装3000ml麦汁培养液的5000ml三角瓶中, 在19℃培养箱中培养24小时.
6.将三角瓶中的3000ml酵母培养液转接到装25L麦汁培养液的卡氏罐, 在13℃培养箱中培养24小时～48小时.
7.将卡氏罐中的酵母培养液转接到装300L麦汁培养液的汉生罐(种子罐), 在13℃条件下培养24小时～48小时.
4.1.3.1斜面菌种挑取应在距离斜面顶部1/3处边缘部位轻挑一菌耳。

液体管之间的活化过程采取用无菌吸管吸取
0.5ml注入10ml液体管内，其他接种方式为全部到入(对瓶口粘培养液的用火烤干再塞盖)。

4.1.3.2对采用软管连接进行接种时，乳胶管能够进行拉刷刷洗时进行拉刷清洗，用前连
同罐一同蒸汽杀菌或采取105℃干热灭菌30分钟后放无菌室备用，为防止胶管老
化，定期更换。

不能采取拉刷刷洗时，水冲洗后用75%酒精进行浸泡备用。

连接
管路进行蒸汽杀菌。

假单胞菌属于细菌的一科。

以极生鞭毛运动，不形成芽孢，化能有机营养，严格好氧，呼吸代谢，从不发酵。