第六章3高效液相色谱法 实用中药鉴定学课件
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▪ 紫外光谱法不仅能测定有色物质，而且能测定含不饱和共轭 双键的无色物质。中药材的紫外吸收光谱通常是各组分特征 吸收光谱叠加而成，在一定条件下，同一种药材应有相同的 紫外吸收光谱。但有时对同属不同种药材以及性状和显微鉴 别不易区分的近缘物种的鉴定，单纯依靠紫外吸收光谱往往 不能达到分离和鉴定的目的，这时可采用导数光谱法来帮助 解决光谱干扰问题。
▪ 色谱-光谱联用分析法：色谱法长于复杂化合物的分离鉴定和光谱法长于 鉴定未知的化学结构，色谱-光谱联用分析法适用于中药化学成分的分离 和结构鉴定。常用方法有气相－质谱（GC－MS）、红外质谱（IR－ MS）、高效液相－质谱（HPLC－MS）及质谱－质谱（MS－MS）等。
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中药鉴定新技术新方法
▪ 中药指纹图谱鉴定技术－中药注射剂 ▪ DNA分子遗传标记技术－DNA个体差异 ▪ 计算机图像分析技术－多维立体分析 ▪ X射线衍射法 ▪ 热分析法 ▪ mRNA差异显示法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 生物效价测定法 ▪ 免疫法 ▪ 组织化学色谱法
▪ 磁共振光谱法（NMR）：利用中药总提取物中某些特定元 素的原子（1H或13C）吸收电磁波辐射，以吸收频率为横坐 标，峰强度为纵坐标作图，即得该物质的磁共振谱（ 1H NMR或13C-NMR）。中药的1H NMR指纹图具有高度的特征 性和重现性，可依据1H NMR指纹图上显示的特征共振信号 和数据（δppm）鉴定中药化学成分的结构。
▪ 定性鉴别时，通常固体样品采用溴化钾压片法，液体样品采 用液样点于氯化钾或溴化钾片间，在4000～667cm－1范围 内测定其吸收光谱，所得吸收光谱应与对照图谱一致；含量 测定时，样品液与标准品溶液先后分别装入同一液体吸收池， 在规定波数范围内测定吸收图谱并按规定方法作基线及量取 峰高计算含量。
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红外光谱法（IR）
▪ 通过测定中药粉末、提取物或化学单体的红外吸收曲线，并 根据中药各组分官能团红外吸收峰的差异而鉴别中药品种和 质量的方法，常用于中药定性鉴别和化合物的结构分析。所 用仪器为傅立叶变换红外光谱仪或色散型红外分光光度计。
▪ IR具有特征性强（λ=7～15μm的指纹区，吸收峰多且尖 锐），分析速度快，样品用量少，操作简单、应用较广泛等 特点。
高效液相色谱法
▪ 高敏液相色谱法（HPLC）：采用高压输液泵将流 动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱 方法。注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在 柱内分离后，先后进入检测器，由记录仪、积分仪 或数据处理系统记录色谱信号。
▪ 与气相色谱法相比较，具有适用范围广、流动相选 择性大、色谱柱可反复应用、流出组分易收集等特 点，适用于中药材及中成药的质量分析。HPLC法 的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同配比的 混合溶剂、缓冲液等液体溶液；常用色谱柱填充剂 有硅胶（正相色谱）、化学键合固定相（如十八烷 基硅烷键合硅胶、离子交换树脂填料、凝胶等）；
▪ 性状鉴定内容：形状、大小、表面特征、色 泽、质地、断面、气味、水试、火试等。
▪ 本法具有专属性强，检测灵敏度高、测定速度快等 特点，是目前测定中药材及中成药中微量元素最常 用的方法之一。所用仪器为原子吸收分光光度计。
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其他理化分析法
▪ 质谱鉴定法（MS）：按照带电粒子的质量与电荷的比值 （m/z）大小依次排列形成的质谱图，根据中药提取物的化 学成分所显示的分子离子基峰及进一步裂解碎片峰的不同而 对中药化学成分进行结构鉴定的一种方法。所用仪器为质谱 仪。对中药化学成分结构鉴定时，往往还要辅以IR、UV、 NMR(磁共振谱)等提供的信息，才能准确鉴定分子的结构。
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▪ 中药鉴定的步骤：样品登记、取样、鉴定 （真伪鉴定、杂质检查、浸出物测定和含量 测定、有害物质检查）、填写鉴定报告书
▪ 《中国药典》（2005年版）分一部、二部和 三部及附录，共收载药品3214种，新增525 种。其中一部（中药）共载药1146种，二部 （化学药品）共载药1967种，三部（生物制 品）共载药101种。特点：理化分析手段先 进，质量控制评价全面，品种增删与时俱进， 首创环保理念，完善证病统一。
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蛋白质电泳色谱法
▪ 适用于含蛋白质及氨基酸类成分中药的真伪 鉴定，尤其是动物药及果实种子类中药。
▪ 其原理是：利用中药所含蛋白质带电荷的成 分，在同一电场作用下，由于各组分所带电 荷的性质、数目及分子质量的不同，泳动方 向和速度则不同，最终形成的色谱带条数不 同而达到分离鉴定的目的。常用方法是聚丙 烯酰胺凝胶电泳法。
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高效液相色谱法
▪ 选择量一般为数微升，柱温多为室温，检测 器常用紫外光检测器，所用仪器为液相色谱 仪。
▪ HPLC法不受样品挥发性的约束，只要求样 品能制成澄清溶液而不需要气化，所以特别 适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的 高分子化合物以及离子型化合物（如氨基酸、 蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生 素以及无机盐类等）的分离和鉴定。
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本章小结
▪ 中药鉴定的目的：确保临床用药安全有效 ▪ 中药鉴定的内容：品种真伪鉴定（基源、性
状、显微、理化）；品质纯度鉴定（杂质检 查）；品质优良度鉴定（浸出物测定、含量 测定、有害物质检查） ▪ 中药鉴定的方法：基源鉴定法、性状鉴定法、 显微鉴定法、理化鉴定法 ▪ 中药鉴定的依据：《中国药典》、《部颁药 品标准》及地方药品标准
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紫外光谱法（UV）
▪ 利用中药所含主成分或有效成分，在波长λ=200～400nm处 有最大吸收波长的原理而进行定性定量分析的方法。所用仪 器为紫外分光光度计，所用溶剂在所测波长附近不得产生干 扰吸收峰，所配样品溶液的吸收度读数以在0.3～0.7之间误 差较小，空白对照应用配制样品的同批溶剂。
原子Baidu Nhomakorabea收光谱法（AAS）
▪ 根据从光源辐射出的待测元素特征光波，通过供试 品蒸汽时，被蒸汽中的待测元素的基态原子所吸收， 测定辐射光强度减弱的程度，而求出供试品中待测 元素含量的一种方法。
▪ 原子吸收遵循一般分光光度法的吸收定律，通过比 较对照品和供试品的吸收度，即可求得供试品中待 测元素的含量。
▪ 色谱-光谱联用分析法：色谱法长于复杂化合物的分离鉴定和光谱法长于 鉴定未知的化学结构，色谱-光谱联用分析法适用于中药化学成分的分离 和结构鉴定。常用方法有气相－质谱（GC－MS）、红外质谱（IR－ MS）、高效液相－质谱（HPLC－MS）及质谱－质谱（MS－MS）等。
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中药鉴定新技术新方法
▪ 中药指纹图谱鉴定技术－中药注射剂 ▪ DNA分子遗传标记技术－DNA个体差异 ▪ 计算机图像分析技术－多维立体分析 ▪ X射线衍射法 ▪ 热分析法 ▪ mRNA差异显示法 ▪ 高效毛细管电泳法 ▪ 生物效价测定法 ▪ 免疫法 ▪ 组织化学色谱法
▪ 磁共振光谱法（NMR）：利用中药总提取物中某些特定元 素的原子（1H或13C）吸收电磁波辐射，以吸收频率为横坐 标，峰强度为纵坐标作图，即得该物质的磁共振谱（ 1H NMR或13C-NMR）。中药的1H NMR指纹图具有高度的特征 性和重现性，可依据1H NMR指纹图上显示的特征共振信号 和数据（δppm）鉴定中药化学成分的结构。
▪ 定性鉴别时，通常固体样品采用溴化钾压片法，液体样品采 用液样点于氯化钾或溴化钾片间，在4000～667cm－1范围 内测定其吸收光谱，所得吸收光谱应与对照图谱一致；含量 测定时，样品液与标准品溶液先后分别装入同一液体吸收池， 在规定波数范围内测定吸收图谱并按规定方法作基线及量取 峰高计算含量。
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红外光谱法（IR）
▪ 通过测定中药粉末、提取物或化学单体的红外吸收曲线，并 根据中药各组分官能团红外吸收峰的差异而鉴别中药品种和 质量的方法，常用于中药定性鉴别和化合物的结构分析。所 用仪器为傅立叶变换红外光谱仪或色散型红外分光光度计。
▪ IR具有特征性强（λ=7～15μm的指纹区，吸收峰多且尖 锐），分析速度快，样品用量少，操作简单、应用较广泛等 特点。
高效液相色谱法
▪ 高敏液相色谱法（HPLC）：采用高压输液泵将流 动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱 方法。注入的供试品由流动相带入柱内，各成分在 柱内分离后，先后进入检测器，由记录仪、积分仪 或数据处理系统记录色谱信号。
▪ 与气相色谱法相比较，具有适用范围广、流动相选 择性大、色谱柱可反复应用、流出组分易收集等特 点，适用于中药材及中成药的质量分析。HPLC法 的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同配比的 混合溶剂、缓冲液等液体溶液；常用色谱柱填充剂 有硅胶（正相色谱）、化学键合固定相（如十八烷 基硅烷键合硅胶、离子交换树脂填料、凝胶等）；
▪ 性状鉴定内容：形状、大小、表面特征、色 泽、质地、断面、气味、水试、火试等。
▪ 本法具有专属性强，检测灵敏度高、测定速度快等 特点，是目前测定中药材及中成药中微量元素最常 用的方法之一。所用仪器为原子吸收分光光度计。
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其他理化分析法
▪ 质谱鉴定法（MS）：按照带电粒子的质量与电荷的比值 （m/z）大小依次排列形成的质谱图，根据中药提取物的化 学成分所显示的分子离子基峰及进一步裂解碎片峰的不同而 对中药化学成分进行结构鉴定的一种方法。所用仪器为质谱 仪。对中药化学成分结构鉴定时，往往还要辅以IR、UV、 NMR(磁共振谱)等提供的信息，才能准确鉴定分子的结构。
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▪ 中药鉴定的步骤：样品登记、取样、鉴定 （真伪鉴定、杂质检查、浸出物测定和含量 测定、有害物质检查）、填写鉴定报告书
▪ 《中国药典》（2005年版）分一部、二部和 三部及附录，共收载药品3214种，新增525 种。其中一部（中药）共载药1146种，二部 （化学药品）共载药1967种，三部（生物制 品）共载药101种。特点：理化分析手段先 进，质量控制评价全面，品种增删与时俱进， 首创环保理念，完善证病统一。
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蛋白质电泳色谱法
▪ 适用于含蛋白质及氨基酸类成分中药的真伪 鉴定，尤其是动物药及果实种子类中药。
▪ 其原理是：利用中药所含蛋白质带电荷的成 分，在同一电场作用下，由于各组分所带电 荷的性质、数目及分子质量的不同，泳动方 向和速度则不同，最终形成的色谱带条数不 同而达到分离鉴定的目的。常用方法是聚丙 烯酰胺凝胶电泳法。
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高效液相色谱法
▪ 选择量一般为数微升，柱温多为室温，检测 器常用紫外光检测器，所用仪器为液相色谱 仪。
▪ HPLC法不受样品挥发性的约束，只要求样 品能制成澄清溶液而不需要气化，所以特别 适用于挥发性低、热稳定性差、分子量大的 高分子化合物以及离子型化合物（如氨基酸、 蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生 素以及无机盐类等）的分离和鉴定。
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本章小结
▪ 中药鉴定的目的：确保临床用药安全有效 ▪ 中药鉴定的内容：品种真伪鉴定（基源、性
状、显微、理化）；品质纯度鉴定（杂质检 查）；品质优良度鉴定（浸出物测定、含量 测定、有害物质检查） ▪ 中药鉴定的方法：基源鉴定法、性状鉴定法、 显微鉴定法、理化鉴定法 ▪ 中药鉴定的依据：《中国药典》、《部颁药 品标准》及地方药品标准
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紫外光谱法（UV）
▪ 利用中药所含主成分或有效成分，在波长λ=200～400nm处 有最大吸收波长的原理而进行定性定量分析的方法。所用仪 器为紫外分光光度计，所用溶剂在所测波长附近不得产生干 扰吸收峰，所配样品溶液的吸收度读数以在0.3～0.7之间误 差较小，空白对照应用配制样品的同批溶剂。
原子Baidu Nhomakorabea收光谱法（AAS）
▪ 根据从光源辐射出的待测元素特征光波，通过供试 品蒸汽时，被蒸汽中的待测元素的基态原子所吸收， 测定辐射光强度减弱的程度，而求出供试品中待测 元素含量的一种方法。
▪ 原子吸收遵循一般分光光度法的吸收定律，通过比 较对照品和供试品的吸收度，即可求得供试品中待 测元素的含量。