食品中致病菌PCR检测方法-阪崎肠杆菌

备案号：

ICS SN

中华人民共和国

国家质量监督检验检疫总局

发布

前 言

SN/T XXXX－XXXX《食品中多种致病菌快速检测－PCR方法》分为十一个部分：

─ 第 1 部分：食品中沙门氏菌检测方法；

─ 第 2 部分：食品中志贺氏菌检测方法；

─ 第 3 部分：食品中金黄色葡萄球菌检测方法；

─ 第 4 部分：食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检测方法；

─ 第 5 部分：食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测方法；

─ 第 6 部分：食品中空肠弯曲菌检测方法；

─ 第 7 部分：食品中肠出血性大肠埃希氏菌 O157:H7检测方法；

─ 第 8 部分：食品中副溶血性弧菌检测方法；

─ 第 9 部分：食品中霍乱弧菌检测方法；

─ 第 10 部分：食品中创伤弧菌检测方法；

─ 第 11 部分：食品中阪崎肠杆菌BAX®全自动PCR检测方法。

本标准修改采用Government of Canada Laboratory Procedure MFLP-27 THE DUPONT QUALICON BAX®1） SYSTEM METHOD FOR THE DETECTION OF ENTEROBACTER SAKAZAKII IN SELECTED FOODS （2003.9）本标准的附录A是资料性附录。

本标准由国家认可监督管理委员会提出并归口。

本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。

本标准起草人：卢行安等。

本标准系首次发布的检验检疫行业标准。

1） 为美国杜邦公司（DuPont Qualicon）产品。

食品中多种致病菌快速检测－PCR方法

第11部分：食品中阪崎肠杆菌BAX®全自动PCR检测方法

1 范围

本部分规定了用BAX®全自动PCR技术快速检测阪崎肠杆菌的方法。

本部分适用于食品中阪崎肠杆菌的检验。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

ISO TC 34/SC 5 N: Milk and milk products-Detection of Enterobacter sakazakii.

FDA/BAM 2002 “Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula”.

GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。

WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用。

3 防污染措施

参照标准《临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用》(WS/T 230)中 6：污染的预防和控制。

4 定义和缩略语

4.1

PCR：(polymerase chain reaction)聚合酶链反应，简称PCR。

4.2

阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii

阪崎肠杆菌为肠杆菌科肠杆菌属革兰氏阴性无芽孢杆菌，周身鞭毛有动力，大多数产黄色素，具有ɑ-葡萄糖苷酶活性，生化特征与阴沟肠杆菌相似，但不发酵D－山梨醇。

5 原理

BAX®阪崎肠杆菌检测系统是应用PCR技术检测食品中的阪崎肠杆菌的自动方法。自动化的BAX®系统的检测对象是阪崎肠杆菌特有的一段DNA片段。只需要很微量的阪崎肠杆菌，BAX®系统的PCR技术就可以扩增出目的DNA片段。目的DNA与DNA聚合酶、核苷酸以及特异于特定核苷酸序列的引物混和在一起。混合物接着进行一系列定时的加热和冷却循环。加热变性DNA，将DNA分离成单链。当混合物冷却时，引物识别目的DNA序列并与之结合。然后，DNA聚合酶利用核苷酸延伸引物，从而产生两个拷贝的目的DNA片段。重复变性、退火和延伸循环可以使目的DNA片段的量呈指数级增长。

一旦扩增反应开始，BAX®系统PCR片剂中的荧光染料就会与双链DNA结合，光照时发出荧光信号。扩增反应后，BAX®系统开始检测，接着自动化的BAX®系统利用荧光检测来分析PCR产物，从而得到阳性或阴性结果。

BAX®系统通过将引物、聚合酶、核苷酸和阳性对照制成片剂放入PCR管中简化了整个过程。另外，自动化的荧光检测使得检测不用开盖，排除了扩增DNA受到污染的可能。

6 试剂和材料

6.1 mLST-Vm肉汤：见附录A1。

6.2 BHI肉汤：见附录A2。

6.3 营养琼脂：见附录A3。

6.4 显色培养基琼脂（Xα-GlcA）：见附录A4。

6.5 ɑ-葡萄糖苷酶生化试剂。

6.6 API 20E生化鉴定试剂盒2）。

6.7 阪崎肠杆菌标准菌株。

6.8 BAX®阪崎肠杆菌的PCR检测试剂盒（Qualicon ＃17720657），5±3℃放置。

6.8.1 PCR片剂：2袋，每个PCR管中一个片剂，12个八连管。片剂包括检测反应和内置阳性对照反应所需的试剂（有了内置阳性对照不需另设质控反应）。

6.8.2 PCR管盖：1袋，12个八连管盖。

6.8.3 裂解缓冲液：2瓶，12mL/瓶；pH8.35±0.05（25℃），用于制备工作裂解液。

6.8.4 蛋白酶溶液：1瓶，400μL/瓶。用于制备工作裂解液。

7 仪器和设备

7.1 干烤箱。

7.2 高压蒸汽灭菌锅。

7.3 恒温培养箱：36℃±1℃ 30℃±1℃ 46℃±1℃。

7.4 冰箱：2℃～5℃。

7.5 天平：感量0.1g。

7.6 无菌吸管：1mL（具0.O1mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸头。

7.7 无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL。

7.8 无菌培养皿：直径为90mm。

7.9 无菌试管。

7.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。

7.11 均质器。

7.12 振荡器。

7.13 无菌刀、剪子、镊子等。

7.14 PCR超净工作台。

7.15 微量可调移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）和相应吸头。

7.16 BAX®全自动病原菌检测系统（启动包）。

8 检验程序

BAX阪崎肠杆菌PCR方法检验程序见图1。

2） 法国生物梅里埃公司产品