水稻转基因实验操作[2]

水稻转基因实验操作
（谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理）
（2006.7）
一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）
1．消毒：
取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；
2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟；
3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。

2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14颗；
2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4周；
3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2周。

(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)
二、农杆菌（工程菌）培养
挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100µl于4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为
0.8-1.0。

三、感菌与共培养
1）取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。

用含200µmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。

2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。

3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；
4）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。

28℃（组培室）暗培养2.5天。

四、愈伤组织的抗生素筛选
将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。

再用含500mg/L羧苄青霉素（Car）的无菌水浸泡30min-1h。

最后置于无菌滤纸上沥干2h。

1）第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素（Car）和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，光照培养箱（30℃，24h光照）中培养14天。

2）将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素（Car）和80mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，30℃，光照培养10天，然后转移到组培室中培养4天。

3）将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素（Car）和80mg/L潮霉素的培养基上进行第三轮选择，组培室中（28℃，16h光/8h暗）培养21天。

五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根
挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中，用封口膜封好，
放入恒温培养室中，等待分化成苗（30-60天）。

苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗。

注：分化过程中不可将愈伤继代培养。

以上操作步骤皆在无菌条件下进行。

六、转基因苗的锻炼和移栽
转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。

将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。

七、转化苗的检测验证
1）GUS检测：将准备好的材料浸泡在染液里，37℃保温过夜。

GUS染液成分见附录。

2）GFP检测：将材料放在共聚焦显微镜下观察成像。

3）PCR检测：设计潮霉素抗性基因引物HYG-F 5` CTTCTGCGGGCGA TTTGT 3`
HYG-R 5` CAGCGTCTCCGACCTGA T 3` PCR 反应条件为：95℃变性5min，55℃退火2min，72℃延伸2min，72℃保温10min。

反应结束后，PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。

4）潮霉素快速检测转基因幼苗的方法（具体见附录）。

附录：
各种母液及培养基的配制方法
一、溶液配制
30%次氯酸钠溶液：V NaClO：VH2O=1：2
70%酒精：稀释100%或95%的乙醇至70%
二、激素的配制
激素溶解方法母液浓度
6-BA 加稀碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容 1 mg/ml
NAA 加碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容 1 mg/ml
2，4-D 加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容0.25 mg/ml
三、母液的配制
1）抗生素
链霉素（Str）50mg/ml：溶解0.5g链霉素硫酸盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。

壮观霉素（Spec）50mg/ml：溶解0.5g壮观霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。

羧苄青霉素（Car）50mg/ml：溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。

卡那霉素（Kan）50mg/ml：溶解0.5g卡那霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20℃贮存。

2）其他
乙酰丁香酮（As 100mM）：称取0.1962克As溶解于10ml二甲亚砜中，用1.5mleppendorf 管分装成小份-20℃贮存。

3）水稻苗期水培营养液配方：
1．制备大量元素营养液母液时，各种盐类分别溶解，分别储存，使用时每升营养液加1mL 母液。

2．制备微量元素营养液（除Fe外）时，先放500mL去离子水，称取各种盐类逐一溶解后，入容量瓶加蒸馏水稀释至1L，制成母液，使用时每升营养液加1mL母液。

3．Fe的制备：溶解5.57g FeSO
4·7H
2
O于200 mL蒸馏水，再另溶解7.45g Na
2
-EDTA 200mL
蒸馏水中，加热Na
2-EDTA（大约70度），加入FeSO
4
·7H
2
O，不断搅拌，然后于70度恒
温箱中螯合2h，冷却定容至1L，储于棕色瓶中，使用时每升营养液加1mL母液。

4．调节pH为5.5。

5．铵营养时，加入硝化抑制剂（双氰胺），每升营养液加2mg双氰胺（终浓度）。

6．各人配制时，应注意所用的盐类和分子量，检查盐用量准确无误。

四、培养基母液配方
1．培养基母液配方：
1）N6培养基母液（20倍）：
每升含：
KNO356.6g
CaCl2·2H2O 3.32g （相当于CaCl2 2.506g）
MgSO4·7H2O 2.70g
KH2PO48.0g
(NH4)2SO49.26g
注：
配制时按表中所列顺序逐一添加，每种成分溶解后再溶解另外一种成分。

2）B5微量母液(100倍)：
每升含：
KI 0.0750g
H3BO30.30g
MnSO4·H2O 1.0g
ZnSO4·7H2O 0.2g
Na2MoO4·2H2O 0.025g
CuSO4·5H2O 0.0025g
CoCl2·6H2O 0.0025g
3）B5有机母液：
烟酸（Nicotinic acid）1mg/ml
盐酸吡哆醇(VB6)1mg/ml
盐酸硫胺素(VB1)10 mg/ml
肌醇(myo-Inositol) 10 mg/ml
4)铁盐(100倍)：
FeSO4·7H2O 2.78g
Na2EDTA·2H2O 3.73g
注：配制顺序如下
1.称取
2.78g FeSO4·7H2O溶解于200ml去离子水中（A）。

2.称取
3.73g Na2-EDTA·2H2O溶解于200 ml去离子水中（B）。

3.将B置于70℃水浴锅中直至溶质完全溶解（C）。

4.将A倒入C中混合，置于70℃水浴锅中保温2h。

5.定容至1L。

5）AA大量元素母液（每升含量）：
KCl 2.95g
CaCl2·2H2O 0.15g
MgSO4·7H2O 0.25g
NaH2PO4·2H2O0.15g
2.培养基配方
1)粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基（每升含量）：
N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇：10ml L-pro: 2.8g蔗糖：30g CH : 0.3g2,4-D : 8ml Phytagel: 4.0g PH值：5．8
2)粳稻成熟胚愈伤组织继代培养基（每升含量）：
N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml
肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 2.8g CH : 0.3g2,4-D 8ml蔗糖30g Phytagel: 4.0g PH值：5．8
3)粳稻共培养培养基（每升含量）：
N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇： 2 g MES 3.9g蔗糖30g CH : 0.5g Phytagel: 4.0g
PH值：5．555℃时加As 至终浓度为200μM
4) 选择培养基每升含量：
N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g CH : 0.3g2,4-D : 8ml麦芽糖/蔗糖：30g Phytagel: 4.0g PH值：5．8
灭菌后(55℃)再加：
第一轮选择：Car（羧苄青霉素）250 mg/L Hgy（潮霉素）50 mg/L
第二轮选择：Car（羧苄青霉素）250 mg/L Hgy（潮霉素）80 mg/L
第三轮选择：Car（羧苄青霉素）250 mg/L Hgy（潮霉素）80 mg/L
5）粳稻分化培养基配方（每升含量）：
N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g CH : 0.3g6-BA: 3 ml NAA 0.5 ml 蔗糖：30g Agar8 g
PH值：5．8
6）粳稻生根培养基配方（每升含量）：
N6大量元素：25ml B5微量：5ml铁盐：5ml
烟酸：0.5ml盐酸吡哆醇：0.5 ml盐酸硫胺素：0.5 ml 肌醇：5ml蔗糖：20g agar: 8.0g
pH5.8
7）农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：
酵母提取物10g
蛋白胨10g
NaCl 5g
pH 7.0
灭菌结束后加抗生素至终浓度为：链霉素(Str)50mg/L
壮观霉素（Spec）50mg/L
8）悬浮农杆菌感染愈伤组织团的培养基配方（AAM）每升含量：
AA大量元素：100ml B5微量：10ml铁盐：10ml
烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml
肌醇：10ml MES： 3.9 g CH : 0.5g
麦芽糖：30g PH值：5．5
55℃时加As至终浓度为200μM
五、GUS染色液配方
(1)制备方法：A液：称取NaH2PO4·2H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。

B液：称取
Na2HPO4·12H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。

(2)取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO4·2H2O调至pH7.0。

(3)染色液：
1.除了TritonX-100, 甲醇, X-Gluc不用灭菌外其他的母液都要灭菌.其中K3[Fe(CN)6]和
K4[Fe(CN)6]要用过滤灭菌的方法
2.GUS活性的精确定位需要有亚铁离子。

GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2-，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。

材料准备：
(1) 瞬时表达检测取浸染后的愈伤，稳定表达取分化前的愈伤。

(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小块、小片）。

直接染色法
将准备好的材料浸泡在染液中，于37℃保温过夜。

六、潮霉素快速检测转基因幼苗的方法
1、检测培养基
成分：0.7% agar，1ml/L的6-BA，200mg/L的Hgy。

方法：先将只含有agar的去离子水煮沸，等冷却至55℃时加相应浓度的6-BA和Hgy，倒至培养皿中。

注：6-BA用于叶片的保鲜，检测培养基的配制无需灭菌处理，但培养皿需要烘干。

2、取样
剪取并收集待检测苗1cm左右长的新鲜绿色叶片（两端均留有切口），平放于培养基上，30℃，16h光/8h暗培养48h,叶片依旧保持鲜绿的即为阳性植株，而阴性幼苗的叶片出现块状坏死。

七、组培常用仪器的使用及维护
（一）灭菌锅
1、逆时针方向旋转门把手，打开门盖板。

2、加去离子水至没过锅底。

3、装载消毒物于灭菌室。

4、将们推至固定轴后，顺时针方向旋紧把手（手力可及）。

5、设定灭菌温度与时间，培养皿和培养基之类为121℃20min。

6、机器开始自动运行，闻铃声响表示灭菌完毕，按power键待压力降至0时开盖取物。

注意事项：
1、锅内加的水一定要为去离子水，以避免锅底水垢产生。

2、锅内的水一定要没过底部平板，以防甘烧。

3、每次灭菌之前都要检查灭菌的时间温度设置。

4灭菌完毕压力未降至0时，千万不要随意打开顶盖。

（二）超净工作台
1.实验前将紫外灯开启20min以上。

2.用棉球蘸取70%酒精将超净工作台整个空间擦拭一遍。

3.进行无菌操作时，动作尽量轻柔，时刻保持无菌意识。

（三）无菌室
无菌室应定期（每星期）用７０％酒精或84消毒液消毒，配合紫外线灭菌灯每次开启20分钟以上，以使无菌室经常保持高度的无菌状态。