第18章 分子遗传学研究方法
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第十八章 分子遗传学研究方法
本章内容 1. 核酸的研究方法 2. 蛋白质的研究方法 3. 蛋白质组学 4. 核酸-蛋白质互作 5. 模式生物
一、核酸的研究方法
1. 通过凝胶电泳按其大小分离DNA和RNA分子。
脉冲凝胶电泳
2. 限制性内切酶在特定位置切割DNA分子。
限制性内切酶EcoRI对DNA片段的消化
酵母的重组性转化
酵母有丝分裂细胞周期
4. 拟南芥。
--单倍体与二倍体相转换迅速 --反向遗传中易于转化 --表观遗传
拟 南 芥 生 活 周 期 的 相
5. 线虫。
--快速生活周期 --细胞系研究 --细胞凋亡 --RNAi
线虫的生活周期
线虫体节
6. 果蝇。
--生长周期快 --首先定位的基因组 --致死研究 --遗传嵌合体
链终止法进行DNA测序
DNA测序凝胶
14. 散弹对一个细菌基因组进行测序。 15. 散弹策略可以允许一个大的基因组序列进 行组装。
全基因组文库的构建与测序策略
通过测定大片段DNA末端序列连接各个contig
16. 末端配对策 略可以组装大的基因 组scaffold。
一个含有长度5 kb的随机 基因组DNA插入的散弹 文库
--附着层析（affinity chromatography） --免疫附着层析（immunoaffinity chromatography） --免疫沉淀（precipitation）
7. 聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质分离。
--SDS
SDS凝胶电泳图
8. 抗体可用于测定电泳分离的蛋白质。
--免疫印迹（immunobloting）
染色质免疫沉淀（ChIP）
3. 染色质免 疫沉淀可检出细 胞中蛋白质与 DNA的关联性。
4. 体外选择可用于鉴别蛋白质的DNA或RNA 连接位点。
体外选择规划 SELEX序列标记
五、模式生物
1. 噬菌体。
--互补测验 --转导 --重组DNA
噬菌体的溶解性生长
噬菌体的溶原性生长
通过对细菌细胞的噬菌体感染形成的菌斑
用液相色谱结合质谱 分析分离蛋白质
酵母的物理互作图
四、核酸-蛋白质互作
1. DNA电泳移动可通过蛋白质连接改变。
--电泳移动迁移测定（electrophoretic mobility-shift assay, EMSA）
核酸酶保护footprinting
2. 连接上DNA的 蛋白质保护DNA免受 核酸酶的水解与化学 修饰。
17. 1000美元人类基因组可以做到。
454测序仪器上的单个孢子图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ、蛋白质的研究方法
1. 特异性蛋白可以从细胞抽提物中纯化。 2. 纯化一种蛋白需要一种特异性方法。 3. 含有活性蛋白的细胞抽提物的制备。 4. 用柱状层析可分离蛋白质。
--离子交换层析 --凝胶过滤层析
6. 附着层析有助蛋白纯化的速度提高。
--基因组文库 --cDNA文库 --反向转录
10. 杂交可以用于 鉴别DNA文库中的特异 性克隆。
11. 化学合成寡合苷酸。
12. 体外可以通过DNA复制的重复路径实现 聚合酶链式反应扩增DNA。
聚合酶链式反应（PCR）
13. 巢式DNA片段组揭示核苷酸序列。
DNA测序中使用的双脱氧核苷酸
存在双脱氧核苷酸情况下的链终止
免疫印迹
9. 蛋白质分子可以直接测序。
--串联质谱分析法（tandem mass spectrometry, MS/MS）
Edman降解法测序
三、蛋白质组学
1. 液相色谱结合质谱 分析法鉴别复合抽提物中 的单个蛋白质。
用液相色谱-MS/MS分析蛋白质 混合物成分
2. 蛋白质组比较 鉴别细胞间的重要差 异。 3. 质谱分析法还 可以控制蛋白质的修 饰状态。 4. 蛋白质与蛋白 质互作可以获得蛋白 质功能的信息。
Southern blot
5. 特异性DNA片段的分离。 6. DNA克隆。
--DNA克隆（DNA cloning） --插入DNA
7. 质粒载体的DNA 克 隆。
--质粒（plasmids） --DNA连接酶 --表达载体
8. 载体DNA可以通过 转化导入宿主生物中。
9. 通过克隆可以构 建DNA文库。
一些限制性内切酶及其识别序列
不同内切酶的识别序列与切割位点 EcoRI位点的切割
3. DNA杂交可以用于鉴别特异性DNA分子。
--杂交（hybridization） --探针（probe）
4. 杂交探针可以鉴别电泳分离的DNA和RNA。
--Southern blot hybridization --放射自显影（autoradiogram）
单一步骤生长曲线
2. 细菌。
--克隆 --转座 --DNA重组 --细胞分析
细菌生长曲线 携带F质粒的细胞的3种形态
噬菌体介导的一般性转导
--一般性转导 --专一性转导 --基因的基本特征特性
转座子引致的插入性突变
转座子引起的lacZ融合
芽殖酵母的生活周期
3. 酵母。
--遗传分析 --精确突变
果蝇生活周期
果蝇幼虫发育的设想方向
遗传图、多线染色体、缺失定位
雌 雄 异 体
杂 交 劣 生
FLP-FRT
P-元件转化
7. 小鼠。
--胚胎发育与基因敲除
本章内容 1. 核酸的研究方法 2. 蛋白质的研究方法 3. 蛋白质组学 4. 核酸-蛋白质互作 5. 模式生物
一、核酸的研究方法
1. 通过凝胶电泳按其大小分离DNA和RNA分子。
脉冲凝胶电泳
2. 限制性内切酶在特定位置切割DNA分子。
限制性内切酶EcoRI对DNA片段的消化
酵母的重组性转化
酵母有丝分裂细胞周期
4. 拟南芥。
--单倍体与二倍体相转换迅速 --反向遗传中易于转化 --表观遗传
拟 南 芥 生 活 周 期 的 相
5. 线虫。
--快速生活周期 --细胞系研究 --细胞凋亡 --RNAi
线虫的生活周期
线虫体节
6. 果蝇。
--生长周期快 --首先定位的基因组 --致死研究 --遗传嵌合体
链终止法进行DNA测序
DNA测序凝胶
14. 散弹对一个细菌基因组进行测序。 15. 散弹策略可以允许一个大的基因组序列进 行组装。
全基因组文库的构建与测序策略
通过测定大片段DNA末端序列连接各个contig
16. 末端配对策 略可以组装大的基因 组scaffold。
一个含有长度5 kb的随机 基因组DNA插入的散弹 文库
--附着层析（affinity chromatography） --免疫附着层析（immunoaffinity chromatography） --免疫沉淀（precipitation）
7. 聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质分离。
--SDS
SDS凝胶电泳图
8. 抗体可用于测定电泳分离的蛋白质。
--免疫印迹（immunobloting）
染色质免疫沉淀（ChIP）
3. 染色质免 疫沉淀可检出细 胞中蛋白质与 DNA的关联性。
4. 体外选择可用于鉴别蛋白质的DNA或RNA 连接位点。
体外选择规划 SELEX序列标记
五、模式生物
1. 噬菌体。
--互补测验 --转导 --重组DNA
噬菌体的溶解性生长
噬菌体的溶原性生长
通过对细菌细胞的噬菌体感染形成的菌斑
用液相色谱结合质谱 分析分离蛋白质
酵母的物理互作图
四、核酸-蛋白质互作
1. DNA电泳移动可通过蛋白质连接改变。
--电泳移动迁移测定（electrophoretic mobility-shift assay, EMSA）
核酸酶保护footprinting
2. 连接上DNA的 蛋白质保护DNA免受 核酸酶的水解与化学 修饰。
17. 1000美元人类基因组可以做到。
454测序仪器上的单个孢子图
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ、蛋白质的研究方法
1. 特异性蛋白可以从细胞抽提物中纯化。 2. 纯化一种蛋白需要一种特异性方法。 3. 含有活性蛋白的细胞抽提物的制备。 4. 用柱状层析可分离蛋白质。
--离子交换层析 --凝胶过滤层析
6. 附着层析有助蛋白纯化的速度提高。
--基因组文库 --cDNA文库 --反向转录
10. 杂交可以用于 鉴别DNA文库中的特异 性克隆。
11. 化学合成寡合苷酸。
12. 体外可以通过DNA复制的重复路径实现 聚合酶链式反应扩增DNA。
聚合酶链式反应（PCR）
13. 巢式DNA片段组揭示核苷酸序列。
DNA测序中使用的双脱氧核苷酸
存在双脱氧核苷酸情况下的链终止
免疫印迹
9. 蛋白质分子可以直接测序。
--串联质谱分析法（tandem mass spectrometry, MS/MS）
Edman降解法测序
三、蛋白质组学
1. 液相色谱结合质谱 分析法鉴别复合抽提物中 的单个蛋白质。
用液相色谱-MS/MS分析蛋白质 混合物成分
2. 蛋白质组比较 鉴别细胞间的重要差 异。 3. 质谱分析法还 可以控制蛋白质的修 饰状态。 4. 蛋白质与蛋白 质互作可以获得蛋白 质功能的信息。
Southern blot
5. 特异性DNA片段的分离。 6. DNA克隆。
--DNA克隆（DNA cloning） --插入DNA
7. 质粒载体的DNA 克 隆。
--质粒（plasmids） --DNA连接酶 --表达载体
8. 载体DNA可以通过 转化导入宿主生物中。
9. 通过克隆可以构 建DNA文库。
一些限制性内切酶及其识别序列
不同内切酶的识别序列与切割位点 EcoRI位点的切割
3. DNA杂交可以用于鉴别特异性DNA分子。
--杂交（hybridization） --探针（probe）
4. 杂交探针可以鉴别电泳分离的DNA和RNA。
--Southern blot hybridization --放射自显影（autoradiogram）
单一步骤生长曲线
2. 细菌。
--克隆 --转座 --DNA重组 --细胞分析
细菌生长曲线 携带F质粒的细胞的3种形态
噬菌体介导的一般性转导
--一般性转导 --专一性转导 --基因的基本特征特性
转座子引致的插入性突变
转座子引起的lacZ融合
芽殖酵母的生活周期
3. 酵母。
--遗传分析 --精确突变
果蝇生活周期
果蝇幼虫发育的设想方向
遗传图、多线染色体、缺失定位
雌 雄 异 体
杂 交 劣 生
FLP-FRT
P-元件转化
7. 小鼠。
--胚胎发育与基因敲除