基因工程植酸酶表达的优化途径和方法
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信号肽结构的改变可能会提高分泌效率。例如 用经过修饰的人血清白蛋白天然信号肽可使人血清 白蛋白在毕赤酵母中的分泌提高几倍; 在 A 性成熟 因子信号肽和目的基因之间插入一个间隔肽可以提 高外源蛋白的表达水平。Martin 等[ 8] 将烟曲霉中 的 phyA 基因置于 glaA 启动子之下表达。他们在原 来的葡萄糖淀粉酶和外源蛋白之间插入一个 Kex22 蛋白酶切割位点, 这样就能使内源性的 Kex22 蛋白 酶对嵌合体蛋白进行有效的加工处理。在用深层发
酵母是单细胞低等真核微生物, 作为表达系统 具有独特的优点。与大肠杆菌不同的是, 酵母可以 对异源蛋白进行修饰, 当采用酵母信号肽时, 蛋白能 被正确折叠和加工, 然后分泌到培养基中, 能适应工 业化生产的需要。此外, 酵母易培养、繁殖快; 遗传 背景清楚, 便于进行遗传操作, 且使用安全, 已长期 广泛应用于酿酒和食品工业。用于表达外源蛋白质 的甲醇营养型 酵母的宿主菌主要是巴 氏毕赤酵母 ( P. pastoris, Pp) 和多型汉逊酵母( H. polymorpha, Hp) 两种。此类酵母生存能力强, 易于培养, 在廉价 的非选择性或半合成培养基上能高密度生长, 其主 要特性是利用甲醇作为唯一碳源和能量来源。用该 系统表达蛋白可以获得大于 1 g/ L 的目的蛋白, 由 此可把此类系统列入表达量较高的真核表达系统之 一[ 2] 。Seonho 等[ 3] 将 来 源 于 大 肠 杆菌 的 植 酸 酶 AppA2 在毕 赤酵母中表达, 重组植酸 酶分子量 56 kD, 摇瓶发酵最高酶活 272 U/ ml, 最适 pH 3. 5, 最 适温度 55 e 。虽然酵母具有上述优点但也有不尽 人意之处, 在酵母中表达的外源蛋白容易出现过度 糖基化现象, 这一现象可阻碍外源蛋白的运输和分 泌。此外, 外源蛋白还可能形成聚合体而影响表达 效率, 其信号肽加工不完全或蛋白质的内部降解等, 可造成表达产物的差异, 产生极不均一的现象, 为表
1 选择适当的表达系统
微生物、植物、动物都可以作为植酸酶的表达系 统。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中 发展最 早、目前应用最广泛的经典表达系统, 是分子生物学 产业化发展的重要 工具。此系 统具有遗传背 景清 楚、繁殖快、成本低、表达量高、稳定性好以及适用范 围广等优点。Nickolay 等[1] 从变形杆菌基因组中扩 增出植酸 酶 phyA 基因片 段, 在 大肠杆菌 中表达。
第 27 卷增刊 2006 年 9 月
同济 大学 学报 ( 医学 版) JOU RNAL OF T ONGJI UNIVERSIT Y (ME DICAL SCIENCE )
文章编号: 1008- 0392( 2006) S1- 0079- 05
Vol. 27 Suppl. Sep. , 2006
基因工程植酸酶表达的优化途径和方法
植酸酶作用的底物 ) ) ) 植酸常存在于植物性饲 料中, 如玉米、大豆等种子, 如果通过基因工程手段 使植物种子中含有足量的植酸酶, 饲喂过程中它们 在动物的胃肠道中释放出来降解的植酸, 这样就可 省去植酸酶添加剂的生产及在饲料中的添加, 一举 两得, 这无疑是植酸酶应用的最佳方法。通过转基 因植物生产植酸酶有以下优点: ( 1) 植物能利用阳 光、水分、肥料生产植酸酶, 使生产成本达到最低; ( 2) 植物细胞系统可以对表达产物进行糖基化、酰基 化、磷酸化等准确的翻译后加工, 使酶蛋白具有良好 的生物活性; ( 3) 在植物中表达的植酸酶不必进行酶 的纯化, 且能在种子中长期稳定保存, 易于长距离运 输和普及推广; ( 4) 转基因植物可以通过杂交进行植 酸酶基因积累, 或传递给其他非转基因植物[ 5] 。Coel2 lo 等[ 6] 将大肠杆菌的植酸酶基因连同一段液泡定位 表达信号肽序列在胚特异性启动子的控制下转化拟 南芥, 在转基因植株干种子中检测到了植酸酶的活 性, 且内部植酸的水平有所降低, 无机磷酸盐的含量 相对提高。研究表明, 在胚中特异表达的植酸酶能够 在胚发育过程中降低其中的植酸水平。尽管转基因 植物生产植酸酶的优势很明显, 但其自身仍然存在一 些问题。首先, 植物体内重组植酸酶表达量低, 在种 子中的 最大含量仅占可溶性蛋白的 15% 左右。其 次, 重组植酸酶热稳定性、最适 pH、最适温度及抗蛋
龙 元 综述, 刘钟滨 审校
( 同济大学医学院微生物教研室, 上海 200331)
关键词: 植酸酶; 优化; 基因工程
中图分类号: R 37
源自文库
文献标识码: A
植酸酶( phytase) 即肌醇六磷酸水解酶( Myo ) inositol hexaphosphate phosphohydrot ase) , 是催化植 酸及植酸盐分解成肌醇和无机 磷酸盐的一类 磷酸 酶。该酶分为三类: 肌醇六磷酸232磷酸水解酶( 32植 酸酶 EC3, 1, 3, 8) 、肌醇六磷酸262磷酸水解酶( 62植 酸酶 EC3, 1, 3, 26) 和非特异的磷酸单酯酶( EC3, 1, 3, 2) 。在饲料中添加植酸酶能使饲料中的植物有机 磷得到有效的利用, 降低了粪便中有机磷的含量, 减 少了环境污染; 并且减少植酸的抗营养作用, 释放许 多有益的金属离子, 促进动物对蛋白质、氨基酸和碳 水化合物的消化吸收。因此植酸酶的研究已成为酶 制剂研究的一个热点。国内外研究人员已经通过基 因工程的手段成功克隆植酸酶基因, 然后在生物反 应器中高效表达, 以解决植酸酶在原始天然材料中 含量低而难以大量提取的问题。但是植酸酶在表达 过程中受基因内部结构、分泌信号、启动子、发酵条 件等诸多因素影响, 使其表达常常偏低甚至不表达。 因此, 对各种可能影响植酸酶表达的因素进行系统 分析, 通过各种途径提高植酸酶表达并优化其性质 具有十分重要的理论和实践意义。
增刊
龙 元 等: 基因工程植酸酶表达的优化途径和方法
酵( submerged fermentation, SmF ) 技术 分批发酵 时 得到的最大酶活 200 U/ ml。 2. 3 选择高表达的启动子
为了提高外源蛋白的表达, 要使用强启动子。丝 状真菌中常使用的强启动子有纤维素酶的 cbhl、葡萄 糖淀粉酶的 glaA, 32磷酸甘油醛脱氢 酶的 gpdA 等。 木霉的 eglt 基因在 ebhl 启动子的调控下, 其表达量比 原来提高 10 倍。巴斯德毕赤酵母表达最常用的启动 子为乙醇氧化酶 AOX1, AOX2 启动子是甲醇诱导型 启动子。如果外源蛋白不能表达或表达量过低, 可以 选择其他强启动子进行表达。有时也需要构建一个 嵌合型的启动子, 包括强启动子的 TATA 、CAAT 序 列和来自不同启动子的抑制子和增强子。 2. 4 遗传突变
收稿日期: 2006- 06- 23 作者简介: 龙 元( 1979- ) , 女, 硕士生.
E2mail: clevecat 666@ sina. com
纯化 后的植 酸酶活 性为 310 U/ mg, pH 作用 范围 1. 5~ 6. 5, 最 适 pH 为 4. 9, 最适反 应温度 40~ 45 e 。但同时该表达系统也有明显的缺陷, 如表达产 物( 蛋白质) 缺少翻译后修饰, 高表达时易折叠错误 导致表达产物没有活性, 表达的蛋白多以包涵体形 式存在, 需要经过复杂的变性复性过程才能恢复构 象和活性。而且大肠杆菌本身含有内毒素等有毒蛋 白, 可能混杂在终产物里, 导致在医药方面的使用受 到局限[ 2] 。
由于植酸酶是一种胞外酶, 表达的蛋白要分泌 到胞外必须经过信号序列的引导。信号肽与目标蛋 白相融合, 从而在蛋白质加工折叠后引导其分泌到 胞外。信号肽没有严格的专一性, 因而可利用宿主 细胞本身信号序列或在表达载体的启动子后加人一 个编码信号肽的序列, 分泌外源蛋白。有些情况下 外源蛋白自身的信号肽就足够了, 如人血清白蛋白、 酵母转化酶等分泌蛋白, 用其自身的信号肽序列即 可在巴氏德毕赤酵母中成功表达。当不能利用蛋白 本身的信号肽序列时, 可利用表达载体的分泌信号, 如来源于酿酒酵母的 A性成熟因子信号肽和巴斯德 毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽, 其中以 A性成熟因子 信号肽最为成功, 也是使用最广泛的信号肽。
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第 27 卷
白酶的能力等有待进一步改善[ 5] 。 综上所述, 由于每一类表达系统都有其自身的
特点和适用范围, 因此如何选择高效的表达系统就 显得尤为重要。
2 提高植酸酶表达量的方法
2. 1 密码子的优化 在不改变氨基酸组成的前提下, 将编码外源蛋
白的密码子优化为表达系统的偏爱密码子, 可以实 现外源蛋白表达量的显著提高。例如在酵母中表达 量较高的基因 往往是采用酵母本身所 偏爱的密码 子。在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时, 对植酸酶 phyA 基因活性位点保守序列 R81HGX、R85XP 的 两个 Arg 密码子进行优化, 选用毕赤酵母高频使用 的 Arg 密码子 AGA 替换 81 位和 85 位低频使用的 CGT 和 CGG 密码子。在所编码氨基酸序列不变的 情况下探讨密码子优化效果, 结果表明密码子优化 的酵母转化子中植酸酶酶活 可达 47 600 U/ ml, 比 未进行密码子优化的重组酵母酶活提高了 l 倍, 可 见酵母优先利用偏爱密码子, 在一定程度上提高了 翻译速度, 从而提高了酶产量[ 7] 。 2. 2 分泌信号的改造
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同济大学学报( 医学版)
达产物纯化和工业化生产带来困难。且大多酵母表 达系统需要甲醇诱导, 甲醇的浓度和诱导时间直接 影响细胞的生长和外源蛋白的表达, 而且甲醇是有 毒性的化学物质, 给产品的纯化带来一定困难。
同其他表达系统相比, 用曲霉菌表达外源蛋白 质有很多益处: 它具有强的分泌蛋白的能力, 表达的 外源性蛋白有较好的糖基化特性, 分泌途径中存在 分子伴侣能帮助蛋白正确折叠, 因此曲霉菌能分泌 出具有真正活性的成熟蛋白。而且植酸酶基因中 G + C 含量高, 是丝状真菌中高效表达蛋白质编码序 列所 具有的特征之一。Luis 等[ 4] 将分离到的 烟曲 霉的植酸酶基因在黑曲霉中表 达并研究其酶 学性 质, 显示其催化活性有更宽的 pH 范围和更 高的热 稳定性, 且在 37 e 也能保持较高活性。虽然曲霉菌 表达的蛋白产量已经较高, 但是距商业化生产仍有 一定距离。主要原因是在转录水平上 mRNA 的不 稳定性和翻译以及翻译后过程中蛋白质量控制、蛋 白加工等方面的问题, 还有蛋白酶的降解作用。在 今后的工作中可以针对这些问题作出改善以提高外 源蛋白表达产量。
和敏感性的方法。因此能找到一种将植酸酶活性从 酸性水解作用中区分出来的方法, 就能进一步提高 筛选植酸酶高产株的效率。 2. 5 防止外源蛋白降解
外源基因在表达的过程中同时伴随着一定量的 蛋白酶的表达。因此, 表达的外源蛋白就存在被降解 的可能, 在一定程度上影响蛋白质的表达量, 同时, 还 给目的蛋白的纯化带来难度。为了提高外源蛋白在 发酵液中的稳定性, 免受蛋白酶降解, 可采用以下几 种方法: ( 1) 使用蛋白酶缺陷株作为受体菌, 保护外 源蛋白不被降解。( 2) 培养基中添加蛋白胨或酪蛋 白水解物等物质作为蛋白酶的底物。( 3) 可调节溶 液 pH 值抑制蛋白水解酶活性, 防止目的蛋白降解。 ( 4) 突变外源蛋白基因的个别位点, 改变其蛋白序列 中蛋白酶的作用部位使其免受蛋白酶的破坏[9]。 2. 6 发酵条件的优化
要选择一种合适的生产技术, 菌株类型, 培养基 成分, 培养条件以及营养素的利用率都应列入考虑范 围, 因为它们都是影响产量的关键因素。固态发酵 (solid2state fermentat ion, SSF ) 和深层发酵( SmF) 的技 术都已经用于植酸酶的生产。Stockmann 等[10] 研究 了来自多形汉森酵母的植酸酶在深层发酵时缺氧条 件下的产量, 发现在葡萄糖培养基中预培养过的菌株 在缺氧条件下产量提高了 25% , 而非缺氧条件下据
关于通过遗传突变来提高植酸酶产量的报道相 对来说比较少。Chelius 和 Wodzinski 在通过紫外线 突变改良黑曲霉 NRRL 3135 菌株的过程中, 分离出 了一种植酸酶高产株, 比野生株的植酸酶产量高了 3. 3 倍。然而他们方法的应用受到限制, 因 为在初 步筛选时缺乏区分植酸酶和酸性磷酸酯酶的特异性
酵母是单细胞低等真核微生物, 作为表达系统 具有独特的优点。与大肠杆菌不同的是, 酵母可以 对异源蛋白进行修饰, 当采用酵母信号肽时, 蛋白能 被正确折叠和加工, 然后分泌到培养基中, 能适应工 业化生产的需要。此外, 酵母易培养、繁殖快; 遗传 背景清楚, 便于进行遗传操作, 且使用安全, 已长期 广泛应用于酿酒和食品工业。用于表达外源蛋白质 的甲醇营养型 酵母的宿主菌主要是巴 氏毕赤酵母 ( P. pastoris, Pp) 和多型汉逊酵母( H. polymorpha, Hp) 两种。此类酵母生存能力强, 易于培养, 在廉价 的非选择性或半合成培养基上能高密度生长, 其主 要特性是利用甲醇作为唯一碳源和能量来源。用该 系统表达蛋白可以获得大于 1 g/ L 的目的蛋白, 由 此可把此类系统列入表达量较高的真核表达系统之 一[ 2] 。Seonho 等[ 3] 将 来 源 于 大 肠 杆菌 的 植 酸 酶 AppA2 在毕 赤酵母中表达, 重组植酸 酶分子量 56 kD, 摇瓶发酵最高酶活 272 U/ ml, 最适 pH 3. 5, 最 适温度 55 e 。虽然酵母具有上述优点但也有不尽 人意之处, 在酵母中表达的外源蛋白容易出现过度 糖基化现象, 这一现象可阻碍外源蛋白的运输和分 泌。此外, 外源蛋白还可能形成聚合体而影响表达 效率, 其信号肽加工不完全或蛋白质的内部降解等, 可造成表达产物的差异, 产生极不均一的现象, 为表
1 选择适当的表达系统
微生物、植物、动物都可以作为植酸酶的表达系 统。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中 发展最 早、目前应用最广泛的经典表达系统, 是分子生物学 产业化发展的重要 工具。此系 统具有遗传背 景清 楚、繁殖快、成本低、表达量高、稳定性好以及适用范 围广等优点。Nickolay 等[1] 从变形杆菌基因组中扩 增出植酸 酶 phyA 基因片 段, 在 大肠杆菌 中表达。
第 27 卷增刊 2006 年 9 月
同济 大学 学报 ( 医学 版) JOU RNAL OF T ONGJI UNIVERSIT Y (ME DICAL SCIENCE )
文章编号: 1008- 0392( 2006) S1- 0079- 05
Vol. 27 Suppl. Sep. , 2006
基因工程植酸酶表达的优化途径和方法
植酸酶作用的底物 ) ) ) 植酸常存在于植物性饲 料中, 如玉米、大豆等种子, 如果通过基因工程手段 使植物种子中含有足量的植酸酶, 饲喂过程中它们 在动物的胃肠道中释放出来降解的植酸, 这样就可 省去植酸酶添加剂的生产及在饲料中的添加, 一举 两得, 这无疑是植酸酶应用的最佳方法。通过转基 因植物生产植酸酶有以下优点: ( 1) 植物能利用阳 光、水分、肥料生产植酸酶, 使生产成本达到最低; ( 2) 植物细胞系统可以对表达产物进行糖基化、酰基 化、磷酸化等准确的翻译后加工, 使酶蛋白具有良好 的生物活性; ( 3) 在植物中表达的植酸酶不必进行酶 的纯化, 且能在种子中长期稳定保存, 易于长距离运 输和普及推广; ( 4) 转基因植物可以通过杂交进行植 酸酶基因积累, 或传递给其他非转基因植物[ 5] 。Coel2 lo 等[ 6] 将大肠杆菌的植酸酶基因连同一段液泡定位 表达信号肽序列在胚特异性启动子的控制下转化拟 南芥, 在转基因植株干种子中检测到了植酸酶的活 性, 且内部植酸的水平有所降低, 无机磷酸盐的含量 相对提高。研究表明, 在胚中特异表达的植酸酶能够 在胚发育过程中降低其中的植酸水平。尽管转基因 植物生产植酸酶的优势很明显, 但其自身仍然存在一 些问题。首先, 植物体内重组植酸酶表达量低, 在种 子中的 最大含量仅占可溶性蛋白的 15% 左右。其 次, 重组植酸酶热稳定性、最适 pH、最适温度及抗蛋
龙 元 综述, 刘钟滨 审校
( 同济大学医学院微生物教研室, 上海 200331)
关键词: 植酸酶; 优化; 基因工程
中图分类号: R 37
源自文库
文献标识码: A
植酸酶( phytase) 即肌醇六磷酸水解酶( Myo ) inositol hexaphosphate phosphohydrot ase) , 是催化植 酸及植酸盐分解成肌醇和无机 磷酸盐的一类 磷酸 酶。该酶分为三类: 肌醇六磷酸232磷酸水解酶( 32植 酸酶 EC3, 1, 3, 8) 、肌醇六磷酸262磷酸水解酶( 62植 酸酶 EC3, 1, 3, 26) 和非特异的磷酸单酯酶( EC3, 1, 3, 2) 。在饲料中添加植酸酶能使饲料中的植物有机 磷得到有效的利用, 降低了粪便中有机磷的含量, 减 少了环境污染; 并且减少植酸的抗营养作用, 释放许 多有益的金属离子, 促进动物对蛋白质、氨基酸和碳 水化合物的消化吸收。因此植酸酶的研究已成为酶 制剂研究的一个热点。国内外研究人员已经通过基 因工程的手段成功克隆植酸酶基因, 然后在生物反 应器中高效表达, 以解决植酸酶在原始天然材料中 含量低而难以大量提取的问题。但是植酸酶在表达 过程中受基因内部结构、分泌信号、启动子、发酵条 件等诸多因素影响, 使其表达常常偏低甚至不表达。 因此, 对各种可能影响植酸酶表达的因素进行系统 分析, 通过各种途径提高植酸酶表达并优化其性质 具有十分重要的理论和实践意义。
增刊
龙 元 等: 基因工程植酸酶表达的优化途径和方法
酵( submerged fermentation, SmF ) 技术 分批发酵 时 得到的最大酶活 200 U/ ml。 2. 3 选择高表达的启动子
为了提高外源蛋白的表达, 要使用强启动子。丝 状真菌中常使用的强启动子有纤维素酶的 cbhl、葡萄 糖淀粉酶的 glaA, 32磷酸甘油醛脱氢 酶的 gpdA 等。 木霉的 eglt 基因在 ebhl 启动子的调控下, 其表达量比 原来提高 10 倍。巴斯德毕赤酵母表达最常用的启动 子为乙醇氧化酶 AOX1, AOX2 启动子是甲醇诱导型 启动子。如果外源蛋白不能表达或表达量过低, 可以 选择其他强启动子进行表达。有时也需要构建一个 嵌合型的启动子, 包括强启动子的 TATA 、CAAT 序 列和来自不同启动子的抑制子和增强子。 2. 4 遗传突变
收稿日期: 2006- 06- 23 作者简介: 龙 元( 1979- ) , 女, 硕士生.
E2mail: clevecat 666@ sina. com
纯化 后的植 酸酶活 性为 310 U/ mg, pH 作用 范围 1. 5~ 6. 5, 最 适 pH 为 4. 9, 最适反 应温度 40~ 45 e 。但同时该表达系统也有明显的缺陷, 如表达产 物( 蛋白质) 缺少翻译后修饰, 高表达时易折叠错误 导致表达产物没有活性, 表达的蛋白多以包涵体形 式存在, 需要经过复杂的变性复性过程才能恢复构 象和活性。而且大肠杆菌本身含有内毒素等有毒蛋 白, 可能混杂在终产物里, 导致在医药方面的使用受 到局限[ 2] 。
由于植酸酶是一种胞外酶, 表达的蛋白要分泌 到胞外必须经过信号序列的引导。信号肽与目标蛋 白相融合, 从而在蛋白质加工折叠后引导其分泌到 胞外。信号肽没有严格的专一性, 因而可利用宿主 细胞本身信号序列或在表达载体的启动子后加人一 个编码信号肽的序列, 分泌外源蛋白。有些情况下 外源蛋白自身的信号肽就足够了, 如人血清白蛋白、 酵母转化酶等分泌蛋白, 用其自身的信号肽序列即 可在巴氏德毕赤酵母中成功表达。当不能利用蛋白 本身的信号肽序列时, 可利用表达载体的分泌信号, 如来源于酿酒酵母的 A性成熟因子信号肽和巴斯德 毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽, 其中以 A性成熟因子 信号肽最为成功, 也是使用最广泛的信号肽。
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白酶的能力等有待进一步改善[ 5] 。 综上所述, 由于每一类表达系统都有其自身的
特点和适用范围, 因此如何选择高效的表达系统就 显得尤为重要。
2 提高植酸酶表达量的方法
2. 1 密码子的优化 在不改变氨基酸组成的前提下, 将编码外源蛋
白的密码子优化为表达系统的偏爱密码子, 可以实 现外源蛋白表达量的显著提高。例如在酵母中表达 量较高的基因 往往是采用酵母本身所 偏爱的密码 子。在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时, 对植酸酶 phyA 基因活性位点保守序列 R81HGX、R85XP 的 两个 Arg 密码子进行优化, 选用毕赤酵母高频使用 的 Arg 密码子 AGA 替换 81 位和 85 位低频使用的 CGT 和 CGG 密码子。在所编码氨基酸序列不变的 情况下探讨密码子优化效果, 结果表明密码子优化 的酵母转化子中植酸酶酶活 可达 47 600 U/ ml, 比 未进行密码子优化的重组酵母酶活提高了 l 倍, 可 见酵母优先利用偏爱密码子, 在一定程度上提高了 翻译速度, 从而提高了酶产量[ 7] 。 2. 2 分泌信号的改造
# 79 #
同济大学学报( 医学版)
达产物纯化和工业化生产带来困难。且大多酵母表 达系统需要甲醇诱导, 甲醇的浓度和诱导时间直接 影响细胞的生长和外源蛋白的表达, 而且甲醇是有 毒性的化学物质, 给产品的纯化带来一定困难。
同其他表达系统相比, 用曲霉菌表达外源蛋白 质有很多益处: 它具有强的分泌蛋白的能力, 表达的 外源性蛋白有较好的糖基化特性, 分泌途径中存在 分子伴侣能帮助蛋白正确折叠, 因此曲霉菌能分泌 出具有真正活性的成熟蛋白。而且植酸酶基因中 G + C 含量高, 是丝状真菌中高效表达蛋白质编码序 列所 具有的特征之一。Luis 等[ 4] 将分离到的 烟曲 霉的植酸酶基因在黑曲霉中表 达并研究其酶 学性 质, 显示其催化活性有更宽的 pH 范围和更 高的热 稳定性, 且在 37 e 也能保持较高活性。虽然曲霉菌 表达的蛋白产量已经较高, 但是距商业化生产仍有 一定距离。主要原因是在转录水平上 mRNA 的不 稳定性和翻译以及翻译后过程中蛋白质量控制、蛋 白加工等方面的问题, 还有蛋白酶的降解作用。在 今后的工作中可以针对这些问题作出改善以提高外 源蛋白表达产量。
和敏感性的方法。因此能找到一种将植酸酶活性从 酸性水解作用中区分出来的方法, 就能进一步提高 筛选植酸酶高产株的效率。 2. 5 防止外源蛋白降解
外源基因在表达的过程中同时伴随着一定量的 蛋白酶的表达。因此, 表达的外源蛋白就存在被降解 的可能, 在一定程度上影响蛋白质的表达量, 同时, 还 给目的蛋白的纯化带来难度。为了提高外源蛋白在 发酵液中的稳定性, 免受蛋白酶降解, 可采用以下几 种方法: ( 1) 使用蛋白酶缺陷株作为受体菌, 保护外 源蛋白不被降解。( 2) 培养基中添加蛋白胨或酪蛋 白水解物等物质作为蛋白酶的底物。( 3) 可调节溶 液 pH 值抑制蛋白水解酶活性, 防止目的蛋白降解。 ( 4) 突变外源蛋白基因的个别位点, 改变其蛋白序列 中蛋白酶的作用部位使其免受蛋白酶的破坏[9]。 2. 6 发酵条件的优化
要选择一种合适的生产技术, 菌株类型, 培养基 成分, 培养条件以及营养素的利用率都应列入考虑范 围, 因为它们都是影响产量的关键因素。固态发酵 (solid2state fermentat ion, SSF ) 和深层发酵( SmF) 的技 术都已经用于植酸酶的生产。Stockmann 等[10] 研究 了来自多形汉森酵母的植酸酶在深层发酵时缺氧条 件下的产量, 发现在葡萄糖培养基中预培养过的菌株 在缺氧条件下产量提高了 25% , 而非缺氧条件下据
关于通过遗传突变来提高植酸酶产量的报道相 对来说比较少。Chelius 和 Wodzinski 在通过紫外线 突变改良黑曲霉 NRRL 3135 菌株的过程中, 分离出 了一种植酸酶高产株, 比野生株的植酸酶产量高了 3. 3 倍。然而他们方法的应用受到限制, 因 为在初 步筛选时缺乏区分植酸酶和酸性磷酸酯酶的特异性