引物设计的黄金法则

以下给出的是网页上比较常见的黄金法则。事实上，有些人直接看序列就直接可以设计引物。其实，引物这种东西，并没有想象中的那么难。PCR产物以及有无二聚体这种东西，我用的PP5，实际上也不是绝对的。

PCR引物设计的黄金法则

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6. 碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于

4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

8. 引物5′ 端和中间△G值应该相对较高，而3′ 端△G值较低。

△G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间△G值相对较高，而3′ 端△G值较低（绝

对值不超过9）的引物。引物3′ 端的△G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的△G值可以用Oligo 6软件进行分析）

9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

10. 扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6l kJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。11. 引物应具有特异性。

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做Real Time时,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

1)避免重复碱基，尤其是G.

2)Tm=58-60度。

3）GC=30-80%.

4)3'端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C.

5)正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。

6)PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-250bp之间都可；80～150 bp 最为合适（可以延长至300 bp）。

7)引物的退火温度要高，一般要在60度以上；

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

至于设计软件，PRIMER3,PRIMER5,PRIMER EXPRESS都应该可以的。

做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备---寻找合适的引物非常不容易。

关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。

CONTRAST

5．反转录 PCR

反转录 PCR (Reverse transcriptase-PCR ， RT-PCR)就是以反转录的cDNA 作模板所进行的 PCR 反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆 mRNA 的 5' 和 3' 末端序列，从非常少量的 mRNA 样品构建大容量的 cDNA 文库。在反转录过程中可根据需要选用不同类型的引物，使用基因特异性的引物时， cDNA 第一条链就只有一种，便于对目标基因的表达和多态性进行分析；多聚 T 引物具有将所有的 mRNA 都反转录成 cDNA 的潜力，随机引物可在 mRNA 的绝大多数部位启动转录，产生一群不同起点的 cDNA 。反转录 PCR 可以作为一种独立的操作技术加以应用，也可演变成特殊的 PCR 技术。

6．实时 PCR (Real-time PCR)

通过 PCR 扩增可以检测模板样品中目标 DNA 或 RNA 分子的含量。由于PCR 扩增以指数方式进行，因此根据最后累积的产物的数量似乎可以推算出起始模板分子的拷贝数。但实际上通过这种末端测量产物方式进行定量分析会带来很大的误差。因为。在扩增过程中不可能每一轮反应的扩增效率都是 100% ，在任何一个循环中扩增效率的细微差异都可能导致最终扩增产物累积的差异。

通过特定设计的 PCR 仪器来实时检测 PCR 扩增过程每一轮循环产物的累积数量，可以很好地推算模板的起始浓度。这种工作方式就称为实时 PCR ，同时由于在检测过程中通过检测标记的荧光信号的累积来实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，所以亦称实时荧光 PCR 或实时荧光定量 PCR 。实时 PCR 提供 PCR 扩增的瞬时信息，可以在一种巨大的动力学范围内测量核酸分子的浓度，能够识别扩增效率的差异并对其进行补偿。该技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司设计并推出，其应用不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点。

NCBI中的BLAST2008-03-24 15:29

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FastA和BLAST程序是目前最常用的基于局部相似性的数据库搜索程序，它们都基于查找完全匹配的短小序列片段，并将它们延伸得到较长的相似性匹配。它们的优势在于可以在普通的计算机系统上运行，而不必依赖计算机硬件系统而解决运行速度问题。

BLAST 是目前常用的数据库搜索程序，它是Basic Local Alignment Search Tool的缩写，意为“基本局部相似性比对搜索工具”[Altschul, 1990, 1997]。国际著名生物信息中心都提供基于Web的BLAST服务器。BLAST程序之所以使用广泛，主要因为其运行速度比FastA等其它数据库搜索程序快，而改进后的

BLAST程序允许空位的插入。我们可以访问NCBI的网站在线进行BLAST和FastA的搜索

BLAST搜索

BLAST 算法本身很简单，它的基本要点是序列片段对（segment pair）的概念。所谓序列片段对是指两个给定序列中的一对子序列，它们的长度相等，且可以形成无空位的完全匹配。BLAST算法首先找出代查序列和目标序列间所有匹配程度超过一定阈值的序列片段对，然后对具有一定长度的片段对根据给定的相似性阈值延伸，得到一定长度的相似性片段，称高分值片段对（high-scoring pairs, HSPs）。这就是无空位的BLAST比对算法的基础，也是BLAST输出结果的特征。

BLAST 软件包实际上是综合在一起的一组程序，不仅可用于直接对蛋白质序列数据库和核酸序列数据库进行搜索，而且可以将检测序列翻译成蛋白质或将数据库翻译成蛋白质后再进行搜索，以提高搜索结果的灵敏度(表3.1)。位置特异性叠代BLAST (Position-Specific Iterated BLAST，简称PSI-BLAST)则是对蛋白质序列数据库进行搜索的改进，其主要思想是通过多次叠代找出最佳结果。具体做法是利用第一次搜索结果构建位置特异性分数矩阵，并用于第二次的搜索，第二次搜索结果用于第三次搜索，依此类推，直到找出最佳搜索结果。此外，BLAST不仅可用于检测序列对数据库的搜索，还可用于两个序列之间的比对。

表3.1BLAST程序检测序列和数据库类型

BLAST 程序是免费软件，可以从美国国家生物技术信息中心NCBI等文件下载服务器上获得，安装在本地计算机上，包括UNIX系统和WINDOWS系统的各种版本。但必须有BLAST格式的数据库，可以从NCBI下载，也可以利用该系统提供的格式转换工具由其它格式的核酸或蛋白质序列数据库经转换后得到。对核酸序列数据库而言，不论用哪种方式，都需要很大的磁盘空间；而程序运行时，需要有较大的内存和较快的运算速度，因此必须使用高性能的服务器。对一般用户来说，目前常用的办法是通过NCBI、EBI等国际著名生物信息中心的BLAST服务器进行搜索。北京大学生物信息中心也提供了BLAST数据库搜索服务。需要说明的是，各生物信息中心BLAST用户界面有所不同，所提供的数据库也可能不完全相同，使用前最好先进行适当的选择。欧洲生物信息研究所BLAST 服务器的用户界面(图3.3)比较简洁，提供的数据库和参数很多，用户可以根据不同要求，选择不同的数据库和各种参数。一般情况下，可以先按照系统给定的缺省参数进行初步搜索，对结果进行分析后再适当调整参数，如改变相似性矩阵、增加或减少空位罚分值、调节检测序列滑动窗口大小等。对于核酸序列数据库，一般选择重复序列屏蔽功能，而对于蛋白质序列，特别是球蛋白，通常不必选择重复序列屏蔽功能。

图3.3 欧洲生物信息学研究所的BLAST服务器的用户界面

图3.4 是BLAST程序运行结果实例。这里，检测序列是与细胞凋亡有关的人自噬基因氨基酸序列，通过欧洲生物信息学研究所的BLAST服务器对包括SwissProt和TrEMBL数据库在内的蛋白质数据库进行搜索。输出结果中包括程序名称、版本号以及文献引用出处，以及检索序列的名称、数据库名称；列出相似性值较高的序列条目，以及它们在数据库中的编号和简要说明。每个条目后面给出相似性分数值Score 和期望频率值E，以相似性分数值大小为序排列，分数越高，相似性越大。而E值则表示随机匹配的可能性，E值越大，随机匹配的可能性也越大。最后给出检测序列和目标序列的比对结果(限于篇幅，图中只给出检测序列和一个目标序列的比对结果)。

图3.4 BLAST程序运行结果实例

高级BLAST的参数设置：

1。期望值设定

在蛋白质序列搜索中，期望值的默认值是10。像核酸一样，期望值就是指搜索结果中的击中序列是偶然击中的可能性，因此值越大时偶然击中的可能性越大，击中序列与提交序列同源的可能性越小，这是序列搜索显著性分析的指标之一。E值大于这个默认值的搜索序列是不列入结果报告中的。低E值的报告严谨但匹配的序列少，所以要选择合适的E值，一般可以先选择一个中等值，然后逐步变化，直到满意为止。

2。字长的设定

默认值是3。这与核酸的默认值不一样，主要是因为蛋白质序列的组成单体多样化（20个氨基酸），因此序列的复杂度要比核酸高，单个位置重复出现的几率小（1/20而核苷酸是1/4），因此字长要小。

FastA搜索

FastA 算法是由Lipman和Pearson于1985年发表的（Lipman和Pearson，1985）。FastA的基本思路是识别与代查序列相匹配的很短的序列片段，称为k-tuple。蛋白质序列数据库搜索时，短片段的长度一般是1-2个残基长；DNA序列数据库搜索时，通常采用稍大点的值，最多为6 个碱基。通过比较两个序列中的短片段及其相对位置，可以构成一个动态规划矩阵的对角线方向上的一些匹配片段。FastA程序采用渐进（heuristic approach）算法将位于同一对角线上相互接近的短片段连接起来。也就是说，通过不匹配的残基将这些匹配残基片段连接起来，以便得到较长的相似性片段。这就意味着，FastA输出结果中允许出现不匹配残基。这和BLAST程序中的成对片段类似。如果匹配区域很多，FastA利用动态规划算法在这些匹配区域间插入空位。

由FastA搜索产生的典型输出结果的第一行列出程序名称和版本号，以及该程序发表的杂志。接下来列出所提交的序列，然后是所用参数和运行时间，紧跟这些一般信息的是数据库搜索结果。首先列出搜

索得到的目标序列简单说明，其数目可由用户定义。所列出的目标序列的信息包括：序列所在数据库名称的缩写，目标序列的标识码、序列号和序列名等部分信息。括号中标明匹配部分的残基数。紧接着是由程序计算得到的初始化和优化后的分数值。最后一列是期望值即E值（详见6.7.3节），用来判断比对结果的置信度。接近于0的E值表明两序列的匹配不大可能是由随机因素造成的。

允许空位的BLAST

如上所述，最初的BLAST程序只能用于无空位的比对。经验表明比对结果通常会出现一些无空位但不连续的区域，不难想象，有些高分值片段对可以通过一些相似性较低且有空位的片段连接起来，组成了一些更长的或许更具实际生物学意义的比对。基于上述思路，BLAST算法经过改进允许空位插入（Altshul 等，1997）。为缩短对数据库初始搜索的时间，新的算法只找出一个最好的高分值片段，并以此为基础运用动态规划方法将这一片段向两端延伸，最终产生的比对结果可能有空位插入。由于免去了查找所有高分值片段对的步骤，新的算法比原算法快3倍。对BLAST算法的进一步扩充，可以考虑双序列比对和多序列比对的有效结合，下一章将详细讨论具体算法。

位点特异性BLAST叠代搜索

位点特异性BLAST（Position-Specific Iterated BLAST，简称PSI-BLAST）叠代搜索（Altschul等，1997），是一种将双序列比对和多序列比对结合在一起的数据库搜索方法。尽管以下事实已经基本得到认同：基于序列模式的数据库搜索灵敏度较高、特异性较好，因而可以发现一些距离较远但却具有生物学意义的相似序列；它的不足之处也不能予以忽视。除了需要大量的计算资源这一缺点外，对于搜索结果的分析解释常常相当困难。这些制约因素限制了它的实际使用范围。PSI-BLAST的基本思路在于根据最初的搜索结果，依照预先定义的相似性阈值将序列分成不同的组，构建一个位点特异性的序列谱，并通过多次叠代不断改进这一序列谱以提高搜索的灵敏度。

和其它叠代算法一样，PSI-BLAS方法既有不少长处，也有它的弊病。例如，如果在比对前不把胶原蛋白、同源多聚体等低复杂度的重复序列屏蔽掉，自动叠代搜索过程会因为这些重复序列的干扰而失败（Holm，1998）。假如第一轮的搜索结果出现一个错误序列，那么最终搜索结果中将会出现许多不期望的无关序列。因此，为了尽量去除大量的错误匹配，仔细分析搜索结果给出的同源关系变得非常重要。