流式细胞术常见实验分析

2.2 DNA含量检测与周期分析
2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法 2.2.2 S期特异性检测 2.2.3 M期特异性检测
2.2.1 DNA倍体分析——PI染色法
基本原理：
细胞周期与DNA含量变化极其FCM分析直方图
结果分析
——Guava原软件分析
H
A
W
Red-A Red-W
Red-A
Red-WБайду номын сангаас
2.3 胞内活性氧水平的检测与分析
DCFH-DA单染法
DCFH-DA DCFH-DA进入细胞在细胞内酯酶作 用下脱去二脂形成不发荧光的DCFH， 当细胞内存在H2O2，O2-，OH-等 ROS时被氧化成发绿色荧光的DCF。
DCFH ROS
DCF
注意事项：
结果分析
——数据分析中几种常见图形及分析原则
——四种常见流式实验讲解
林奕婷 2013年8月14日
1. Guava easycyte 8HT 操作流程
2. 四种常见流式细胞术
细胞凋亡的检测与分析 DNA含量检测与细胞周期分析 胞内活性氧水平的检测与分析 细胞表面分子的检测与分析 组合实验
1. Guava easycyte 8HT 操作流程 ——Incyte模块
2.2.3 M期特异性检测
G2期是指DNA合成后期，M期是细胞分 裂期。二者在细胞周期事件中所处的时项 不同，所表示的生物学意义也大不相同。 准确检测M期的变化对细胞增殖、凋亡及 癌症的研究相当重要。M期的检测标志是 丝氨酸磷酸化组蛋白H3(pH3)。当细胞周 期从G2期转换到M期时，染色质上的组蛋 白H3Ser10发生磷酸化，并在有丝分裂后 快速的去磷酸化。由此组蛋白H3的丝氨 酸磷酸化变化将停留在G2期的细胞与M期 的分裂细胞区分开来。
在用第三方软件分析之前，请将流式结果按如下所示导出。
结果分析
——Modfit软件分析
结果分析
——Modfit软件分析
图片拷贝：直接Ctrl+C
结果分析
——Flowjo软件分析
2.2.2 S期特异性检测
S期DNA合成期，S期的比例增多往往与细胞 分裂的活跃程度相关。传统的PI染色可以通过 DNA的倍增区分G1期与G2/M期。S期则因界 限不明显，难以区分。若需要准确的统计S期 的变化，需要加入S期的特异性标志，即BrdU。 BrdU只在DNA合成时被掺入核酸，是指示 DNA复制的金标准。因此可通过BrdU-Alex Fluor® 488与PI复染将S期准确的区分开来。
允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率） 高些，但阳性细胞百分率（近似值）应减去假 阳性率。
样本管峰形整体右移。在排除非特异性染色的情况下（如设置严格 的对照、调节抗体浓度等），方能进行分析。 分析原则： 不可根据阴性对照界定阴性置信区； 可记录平均荧光强度，不可记录阳性细胞百分率。
（3）同时出现弱阳性峰与强阳性峰的组合图形
（自己在做实验之前也可进行easycheck，流程见下面。）
easycheck
微珠：10μL（用前震荡混匀） Buffer：190μL
2. 四种常见流式细胞术
2.1 细胞凋亡的检测与分析
2.1.1 PI单染法 2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法 2.1.3 线粒体膜电位法
凋亡启动
凋亡早期
2.4.1 免疫学检测
数据分析
2.4.2 肿瘤干细胞分析
MCF-7 negative control
MCF-7 CD24
MCF-7 CD44
MCF-7 CD24/CD44
0.08%
0.03%
89.8%
5.35%
侧群细胞
2.5 组合实验
• 细胞周期特异性凋亡检测：AnnexinⅤ染色后用透膜固定 剂固定，然后加入PI进行DNA染色。
结果分析
阴性对照
PI
Annexin Ⅴ-FITC
PI/Annexin Ⅴ-FITC
荧光交叠
荧光补偿原理
荧光补偿
AnnexinⅤ -FITC单染
优缺点：
2.1.3 线粒体膜电位法
488nm
基本原理：
正常细胞
线粒体膜电位下降是细 胞凋亡早期的一个标志 性事件。 JC-1：亲脂性阳离子荧 光染料，特异性地与线 粒体内膜结合，膜电位 高时呈聚合体，膜电位 低时呈单体。
1.1 开机-清洗
（原则：先开仪器后开软件，开机必清洗）
1.2 采集样本
1.3 分析 1.4 关机
（原则：先关软件后关仪器，关机前必清洗）
1.5 日常维护
1.1 清洗
1.2 样本采集
edit WL
• 1.3 分析
见具体实验的分析。
• 1.4 关机
1.5 日常维护
保持空气干燥，会使激光器的使用寿命长一些。
（1）阴性细胞群（峰）和阳性细胞群（峰）分群明显
分析原则： 根据阴性对照界定阴性置信区； 允许阴性对照非特异性荧光信号（假阳性率）一般小于 1%~5%； 可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。
（2）样本管与阴性对照管峰形重叠
样本管峰形左侧右移，右侧有肩峰，弱阳性的 样本常出现此类图形。
分析原则： 根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区应 设在两曲线分离处； 可记录阳性细胞百分率（近似值）或平均荧光 强度或弱阳性；
• 优点：简便，快捷，价廉，应用普遍。
• 缺点：
2.1.2 Annexin-Ⅴ-PI双染法
基本原理：
磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素 Ⅴ（AnnexinⅤ）发生特异结合； PI是核酸荧光染料，不能透过正 常细胞膜，只能进入已经破损的 细胞膜。
正常细胞：膜完整，PS不外翻——PI-/AnnexinⅤ凋亡早期：膜完整，PS翻转——PI-/AnnexinⅤ+ 凋亡晚期：PS外翻，膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+ 坏死细胞：膜严重破损，PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+ 几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
分析原则： 根据阴性对照界定阴性置信区，阴性置信区可设 在两曲线分离处。阳性细胞既含弱阳性细胞又含 强阳性细胞，但阳性细胞百分率应减去假阳性率； 界定先可设在弱阳性返回基线处，阳性细胞仅表 示强阳性细胞； 可记录阳性细胞百分率或平均荧光强度。
2.4 细胞表面分子的检测与分析
2.4.1 免疫学检测 2.4.2 干细胞分析
• 报告基因与细胞周期结合
• 报告基因与细胞凋亡结合
GPF-
GFP+
Total
• ROS与细胞活性结合——DCFH/PI染色法
• 干细胞分析与细胞活性结合——表面标志物抗体/PI染色法
+ + +
-++ - + 590nm
488nm
凋亡细胞
+ - +
529nm
结果分析
用488nm激发，黄光和绿光通道收集荧光信号，调补偿纠正绿色荧光（单体） 和黄色荧光（聚合物）的重叠部分。线粒体膜电位采用比例法，即根据绿色 荧光与黄色荧光阳性百分率之比。 Ratio=G.M./Y.M. 比值升高，膜电位降低，膜受损。
凋亡晚期
2.1.1 PI单染法
基本原理： • 正常细胞DNA含量：2n~4n • 凋亡细胞：核内DNA断裂，乙 醇固定后膜通透性增加，小片 段DNA穿膜丢失，胞内DNA含 量减少。PI染色后，荧光强度 减小而形成一个DNA含量小于 2n的分布区（亚G1峰）。
操作方法与结果分析见细胞周期部分。
优缺点：
桌面不要有震动，以免光路发生偏移。
上机前检查废液瓶是否已满，若已满或将满请倒掉，用超纯水冲洗两 遍，放回原位；洗涤液瓶若已空或将空请补满（ICF：ddH2O=1：4）。
实验台面保持整洁，废物缸请及时倒掉。自己的东西实验后请收走，
流式专用的物品请不要带走。 做完请记得登记。 每周在周一进行一次easycheck。