简并寡核苷酸探针简并探针

• 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA 中有用的序列被切掉）。
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
核酸酶S1
5’
cDNA第一链
3’
3’
cDNA第二链
5’
cDNA 合成
缺点：合成 效率低;〈1% mRNA能合 成cDNA。
• 改进
• RNase H酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA， 并将其降解成许多小片断。
1. 基因特异性 来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分
遗传信息，且只代表正在表达的基因的遗传信息： 2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样，因而有的结 构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官 提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同。
3. 代谢或发育特异性 处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因
此酶是一条单一的多肽链，有RNA聚合酶的活性， RNaseH的活性减弱。
• 引物
1、Oligo dT引物
3’AAAAAAA
mRNA
5’
5’TTTTTTT cDNA 反转录酶
2、随机引物（六聚体寡核苷酸） 这种非特异性引物可沿着mRNA多个位点结合
3、特异性引物。
在总的RNA 中可作为具有 mRNA的特异 引物
文库不能完全 包含基因编码 序列
产生一个大的 具有特定序列 的 cDNA文库
cDNA产物可能 是小的，不具有 多聚腺苷的模板 也被可利用
可产生大量特 定基因的 cDNA文库
产生的cDNA 文库应用范围 有限
• 第一链合成过程
3’
mRNA
5’
5’ 引物
cDNA
反转录酶 3’
3’
mRNA
5’
5’ 引物
一类能引起鸟类等动物白血病、肉瘤以及其它肿瘤的病毒。 其反转录酶由一个α亚基和一个β亚基组成，有二种酶活力。 1）RNA指导的DNA聚合酶活力。 2）RNaseH酶活力，水解RNA—DNA杂种分子中的RNA，可
沿3’→5’和5’→3’两个方向起外切酶作用。
• 莫洛尼氏鼠白血病病毒（MMLV)的反转录酶
表达亦不相同。 4. 不均匀性
在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分子的 数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因 转录而来的。 5. 各cDNA均可获得表达
• 建立cDNA文库的一般程序
1. mRNA的分离与纯化载体DNA片段的制备。 2.双链cDNA 的合成。
1）单链cDNA 的合成：反转录法 2）第二条cDNA 的合成：碱解或酶解（RNaseH）
去引物 DNA ligase
3’
cDNA第二链
cDNA第一链
cDNA末端修饰
• 借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加 上几个C或G，成为粘性末端。
• 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接， 转入受体菌。
接上人工接头
粘性末端
末端转移酶CCC
CCC
•加 人 工 接 头
三、cDNA克隆载体
• 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎 片断。
• DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接酶 连成一整条DNA链。
3’ 5’ 引物
mRNA
cDNA
反转录酶
3’ 5’ 引物
Biblioteka Baidu
mRNA cDNA第一链
RNaseH
3’ mRNA 5’
DNA
聚合酶mRNA cDNA第一链
DNA
聚合酶mRNA
• 含有一个真核启动子
•λZapcDNA 载体的噬菌 粒营救
第二节 cDNA文库的筛选
• 表达分析 • 核酸原位杂交 1、已知氨基酸序列的相关简并密码子探针； 2、纯化蛋白质的相应抗体探针； 3、差异表达的扣除cDNA探针。
一、简并寡核苷酸探针
• 简并探针：是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基 可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性,可 以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏 好,减少简并性。
法除去RNA分子 3. cDNA克隆载体的制备。 4. ds- cDNA与载体DNA 相连。 5. 重组cDNA分子的导入和克隆。
第一节 将RNA转变成cDNA
一、mRNA的分离纯化
1. 总RNA的提取
RNA易遭降解
RNA酶的降解 RNA分子不稳定
• RNA不稳定：核糖环上的2`－OH促使对
磷酸二酯键的亲水性攻击。
• 如果用功能测定来筛选目的基因，可用质 粒载体来构建cDNA的表达文库。
• 如果通过分子杂交或抗体筛选目的基因， 可用噬菌体载体构建cDNA文库。
• λ噬菌体载体－λ Zap cDNA 载体
•λZapcDNA 载体
• 优点： 1、高的转染效率 2、可在体内用M13辅助噬菌体将其变为真核生物的
质粒表达载体。
cDNA第一链
3’
碱 或RNaseH
5’ 引物
cDNA第一链
3’
第二链合成
• 剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链
cDNA第二链合成
DNA聚合酶
5’
cDNA第一链
3’
cDNA第二链
• mRNA只占总RNA的1%-5%。 • 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从
总RNA中分离纯化。 • 方法： 寡聚（dT）-纤维素柱层析法。
mRNA纯化
二、cDNA合成
• cDNA的合成包括第一链和第二链cDNA的合成。 • 第一链cDNA的合成是以mRNA为模板，反转录为
cDNA，有反转录酶催化，该酶合成DNA时需要引 物引导，常用引物是oligo dT。 • 第二链合成是以第一链为模板，由DNA聚合酶催 化。
cDNA的第一链合成
• 反转录：以RNA为模板，合成DNA。与通常转录过程 中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反。
• 禽类成髓细胞瘤病毒（AMV)的反转录酶
• 异硫氰酸胍法：异硫氰酸胍可裂解细胞，使RNA与蛋白质 分离，将RNA释放到溶液中。加入苯酚、氯仿，可促使RNA 进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留 在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）为RNA， 有机层（黄色）为DNA和蛋白质。
RNA分子结构
RNA抽提
2、mRNA的分离纯化
cDNA文库的构建和筛选
1. cDNA
• 以mRNA为模板反转录出的DNA称cDNA。
3’
mRNA
5’
5’ 引物 cDNA 反转录酶
3’
2. cDNA library
利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将 这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进 行保存和扩增，称cDNA文库。
• cDNA文库的特点