用分光光度计测定质粒DNA的浓度
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用分光光度计测定质粒DNA的浓度
一、目的
熟练掌握分光光度法检测DNA纯度和浓度的方法。
二、原理
DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处。波长为260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异。对标准样品来说,浓度为1μg / ml时,DNA钠盐的OD260=0.02当OD260=1时, dsDNA浓度约为50μg / ml ssDNA浓度约为37μg / ml RNA浓度约为40μg / ml寡核苷酸浓度约为30μg / ml(youyu底物不同有差异)
当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260、OD280和OD230,计算其比值来衡量样品的纯度。
经验值:
纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1。6,表明有蛋白质、酚等污染)
纯RNA:1.7 <OD260/OD280<2.0(<1.7时表明有蛋白质或酚污染;>2.0时表明可能有异硫氰酸残存)
若样品不纯,则比值发生变化,此时无法用分光光度法对核酸进行定量,可使用方案二的方法或其他方法进行估算。
三、材料、试剂及器具
1、材料
提取的PUC19样品、PUC19标准样品
2、试剂
灭菌重蒸水,TE缓冲液
四、操作步骤
1、 UV-240紫外分光光度计开机预热10min.
2、用重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干,加入TE缓冲液后,放入样品室的S池架上,关上盖板。
3、设定狭缝后校零。
4、将标准样品和待测样品适当稀释(DNA5μl或RNA4μl用TE缓冲液稀释至1000μl)后,记
录编号和稀释度。
5、把装有标准样品或待测样品的比色皿放进样品室的S架上,关闭盖板。
6、设定紫外光波长,分别测定230nm、260nm、280nm波长时的OD值。
7、计算待测样品的浓度与纯度。
DNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×50/1000
RNA样品的浓度(μg / μl):OD260×稀释倍数×40/1000
PS:对于一般的紫外分光光度计,若用1cm的石英比色皿,则至少稀释到3ml,才能达到光照高度的量。