基因打靶技术
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基因打靶技术
蒋婷 陈丹朔
基因打靶的概念
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术的原理
基因打靶的基本环节
基因打靶的策略
基因打靶技术的应用
什么是基因打靶？
图为：左侧为克隆兔，右侧为“代孕”母兔。
基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方 法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同 源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。它是 一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。尤其是条件性、可诱导性基因打靶 系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。 作为一项新兴的技术，基因打靶有着其无可比拟的优点：基因打靶所适应 的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞；基因打靶能把外源基因引入染 色体DNA 的特定片段上；在设计合理的情况下，基因打靶可对宿主细胞染色 体基因进行精细的改造；基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体 DNA的复制而稳定复制。
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术最早是20世纪70年代在酵母细胞中发展起 来的。对于酵母来说，大多数的外源DNA 片段通过同源重组 整合到基因组内，随机插入仅占小部分，多为同源位点整合， 后来基因打靶技术逐渐应用于哺乳动物细胞，并得到进一步 的发展和改进。 80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行 模式试验，以探索发生同源整合的可能性。1985 年Smithies 等首次成功的运用基因打靶技术，通过带有一条表达β-球蛋 白基因的人染色体的小鼠白血病细胞，引入外援DNA 对人β球蛋白基因进行了修饰，证实了利用同源重组对生物体的遗 传信息进行定向改造的可能性。1989 年，真正通过同源重组 获得的基因敲除小鼠诞生。
基因打靶的基本环节
4 鉴定： 鉴定： 观察被击中细胞的生物学特性，并进行分子生物学检 测。可以用特异PCR 方法鉴定， PCR 引物一端以基因组 DNA 的特定基因座为模板，另一端以导入的外源基因为 模板，这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。 对经PCR 鉴定的克隆用Southern 杂交产生特殊带谱的方 法来进一步确定同源重组克隆。
基因打靶的基本环节
2 .打靶载体的导入 打靶载体的导入：外源DNA 导入的方式主要有显
微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒 法等。目前应用最广泛的是显微注射法。逆转录 病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲 合力，可用于时空特异性的基因打靶，在人类疾 病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
基因打靶的基本环节
• 3 . 筛选：由于真核细胞内发生同源重组的 筛选： 机率非常低，因此要把发生定点整合的细 胞从大量随机整合的细胞中筛选出来，就 成了基因打靶要解决的关键技术问题。目 前筛选的方案有数种，如正负双向选择法、 标记基因的特异位点表达法及聚合酶链反 应法。为了便于筛选重组阳性的细胞克隆， 目前普遍采用正负双向选择策略(PNS),此 外，也可用PCR 技术鉴定筛选基因打靶阳 性的细胞。
基因打靶技术是近20 多年兴起的分子生物学 技术，它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是 一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。作 为新兴的遗传工具，它无论是在理论研究还是在 实践应用方面都有着广阔的前景。随着人类基因 组计划的实施，越来越多的基因被发现，只有一 小部分基因的作用是已知的，将基因打靶技术与 其它生物学技术相结合对解读未知基因的功能、 调控机制和它们之间的相互关系研究起到积极的 作用，相信不久的将来会取得更多新的成果。
基因打靶技术的应用
2 在病理模型和基因治疗方面 对小鼠的MTHFR 基因进行敲除初步研究， 并为将来制 备MTHFR 基因缺陷型小鼠奠定基础。在国内， 运用基因 打靶技术hTERT-TK/GCV 联合hTERT-CD/ 5-FC 基因体 系能够靶向杀伤肝癌细胞，存在明显的旁观者效应，弥补 了治疗转染效率不高的问题，便于指导今后的试验和研究。 基因缺陷型动物模型为遗传性疾病及其他相关疾病提供研 究模型，使实现人类疾病基因治疗成为可能。 3 异体器官移植 赖良学等应用基因打靶技术在猪胎儿成纤维细胞中对 GGTA1基因进行了成功的敲除，核移植后获得了GGTA1 基因敲除猪.同年,PPL 公司的Carol 等利用体细胞二次基 因打靶技术，获得了GGTA1 双等位基因敲除猪。
基因打靶的基本环节
基因打靶载体有基因插入型载体和基因置换型载体两 种类型。插入型载体与靶基因同源的区段中含有特异的酶 切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从 而干扰目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位 点在引导序列和筛选基因的外侧，线性化后，同源重组使 染色体DNA 序列被靶载体序列替换。大多数基因敲除突 变都采取置换型载体进行基因打靶。
基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 • 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) • 精细突变的引入 • 条件性基因打靶
基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略
借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键 的外显子中， 的外显子中，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能 实行靶基因的完全剔除。 域，实行靶基因的完全剔除。进行完全基因剔除首先要 在体外进行目的基因功能的缺失突变 缺失突变。 在体外进行目的基因功能的缺失突变。
基因打靶的基本环节
1. 打靶载体的构建 ：基因打靶载体包括载 体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选 择性标记基因等非同源序列，其中同源序 列是同源重组效率的关键因素，基因打靶 载体的同源重组序列一般可通过特异性探 针从基因组DNA 文库中分离得到，也可以 利用PCR 对基因组目标的DNA 序列进行扩 增得到。
+
-
打靶载体
基因组序列
+
打靶后基因组序列
置换型载体(Gene—replacement vector)
+
打靶载体
基因组序列
+
打靶后基因组序列
插入型载体（Gene-inserLeabharlann Baiduion vector）
tk
+
neo 打靶载体
-
基因组序列
+
打靶后基因组序列
+
打靶载体
基因组序列
+
打靶后基因组序列
Hit and Run
基因打靶技术的应用
在医学方面的应用： 在医学方面的应用： 1 在免疫学方面的应用 将带有基因的激素直接注入受体动物可能成为疫 苗开发的一种途径，同时可用基因打靶观察某一 基因对免疫细胞所发生的影响。有些研究用基因 打靶技术破坏了CD43 基因，结果提高了T 淋巴 细胞的黏附性，为进一步观察和探讨一些免疫机 制奠定了基础。可将人类疾病相关基因或免疫抗 体基因“敲入”小鼠基因组进行表达，是基因功 能研究的有力手段。
基因打靶的策略
• 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene
可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，neo基因插入到 ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的 ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。 在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。 但此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。
基因打靶技术的应用
乳腺生物反应器： 乳腺生物反应器： 基因打靶技术制备乳腺生物反应器可以克服传统的受精卵显微注 射法的众多缺陷，并能对动物内源基因进行修饰。体细胞基因打靶— 核移植技术相结合，使乳腺生物反应器的制备得到发展，通过这种方 法可以得到转基因动物，无需筛选，降低了生产成本且大大缩短了制 作周期。国外试验组开创了“第2 代动物生物反应器模型”研究的先 2 河，直到2000 年该技术用于转基因乳腺生物反应器的研究才取得成 功。 目前已经建立了基于体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器的技术 平台。在羊的乳腺上皮组织细胞中的β-酪蛋白基因位点打靶成功的制 作出转基因的核供体。通过体细胞同源重组技术，首次成功地获得了 抗体基因敲除的山羊胎儿成纤维细胞株，该细胞株可用于体细胞克隆 制备抗体基因功能缺失的转基因山羊。体细胞核移植克隆动物技术的 发展与成功，促进了体细胞打靶制备乳腺生物反应器的发展。还有已 成功构建了人GDNF 基因打靶牛β-酪蛋白基因座的正负筛选打靶载体， 为研究人GDNF 基因在牛β-酪蛋白基因座的定点整合及通过体细胞核 移植法制备人GDNF 牛乳腺生物反应器的研究奠定了基础。
靶基因
PCR扩增
打靶载体
电穿孔法转染ES细胞
内细胞团 ES细胞
小鼠囊胚
同源重组
中靶ES细胞筛选
显微注射
胚胎移植
带突变基因的嵌合体
突变基因经生殖系统遗传
野生型
突变型
基因打靶的基本环节
基因打靶的技术要点如下： ①基因打靶载体的构建 ②打靶载体的导入 ③筛选 ④将重组阳性细胞转入动物胚胎，产生转基因动物，并进 行形态观察和分子生物学检测。
基因打靶的策略
精细突变的引入 打了就走策略 (Hit and Run 法) 双置换法 (Double Replacement法)
“标记和置换”法 (Tag and Exchange法) Cre/ LoxP 系统介导的策略
基因打靶的策略
• 条件性基因打靶
Flox-and-delete条件基因打靶
Flox-and-replace条件基因打靶 Flox-and-invert条件基因打靶
基因打靶技术的应用
培育优良品种： 培育优良品种： 基因打靶操作技术的出现，使转基因动植物研制更为精确，通过 改变动物的遗传特性，提高动物的生产性能，增强其抗病力，最终培 育出满足人们需要的高产、优质、抗病新品种。基因打靶在动物上的 应用研究取得了丰硕的成果，在各种转基因抗病动物研究中，尤其是 转基因鸡的抗病效果比较显著，将小白鼠抗流感病毒基因MXI 转至鸡 细胞中，也使鸡产生对禽流感的抗性；一些利用羊胎儿成纤维细胞中 的同源重组和羊的原代成纤维细胞高频同源重组现象的研究相继取得 成果。另有试验通过基因打靶技术获得了PRNP 基因双位点敲除牛这 种牛携带朊病毒蛋白或其他传染性蛋白。 近些年在国内，实验室研究者利用奶牛rDNA基因的ITS作为靶位 点，来研究用重复序列作为基因打靶的靶位点产生转基因奶牛的价值， 突破了DNA 重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。
基因打靶技术的原理
进行基因打靶，首先要设计和合成一个合适的打靶载体。 该载体不仅含有需要插入的DNA 序列，其两端还含有与 靶基因座上的序列相同的核苷酸片段，即同源重组指导序 列。首先将与细胞内靶基因两端特异片断同源的DNA 分 子分别连接到目的基因的两端，然后将此DNA 片段连接 到带有标记基因的载体上，再将此载体用基因转移的方法 导入靶细胞。通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序 列之间的同源重组，使外源DNA 定点整合到靶细胞的特 定基因座上。同源重组的分子机制目前尚未阐明，但已相 继提出了多种解释同源重组的模型，其中Meselson— Radding 模型不仅可以解释交互重组的现象，而且还可以 圆满地解释基因转变现象，因此被广泛接受。但Szostak 等提出的双链断裂修复模型（DSBR）能更好的解释双链 断裂可以大大提高同源重组的效率这一现象。
Double Replacement
1 2 3
靶基因组序列
tk
1
Hprt
3
打靶载体1
HAT ,GANC
1
Hprt
3
同源重组后序列 打靶载体2
1
2
3
6--TG
1 2 3
带有精细突变的基因组序列
Tag and Exchage
1 2 3
基因打靶的产生和发展
20 世纪90年代后，基因打靶技术得到 了普遍应用和长足发展。随着核移植和体 细胞克隆技术的发展，人们已能对体细胞 进行基因打靶，有些研究利用体细胞基因 打靶成功地获得了基因缺失导致的细胞表 型。
基因打靶的产生和发展
瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布将 2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国 科学家马里奥-卡佩奇和奥利弗-史密西斯、 英国科学家马丁-埃文斯，以表彰他们在胚 胎干细胞和基因打靶研究方面所作的贡献。
蒋婷 陈丹朔
基因打靶的概念
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术的原理
基因打靶的基本环节
基因打靶的策略
基因打靶技术的应用
什么是基因打靶？
图为：左侧为克隆兔，右侧为“代孕”母兔。
基因打靶(gene targeting)技术也称为基因定点同源重组，是利用基因转移方 法, 将外源DNA序列导入靶细胞后, 通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上的同 源DNA序列间的重组, 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点, 或对某一预先确定的靶位点进行定点突变, 从而改变细胞遗传特性的方法。它是 一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。尤其是条件性、可诱导性基因打靶 系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确。 作为一项新兴的技术，基因打靶有着其无可比拟的优点：基因打靶所适应 的细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞；基因打靶能把外源基因引入染 色体DNA 的特定片段上；在设计合理的情况下，基因打靶可对宿主细胞染色 体基因进行精细的改造；基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体 DNA的复制而稳定复制。
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术最早是20世纪70年代在酵母细胞中发展起 来的。对于酵母来说，大多数的外源DNA 片段通过同源重组 整合到基因组内，随机插入仅占小部分，多为同源位点整合， 后来基因打靶技术逐渐应用于哺乳动物细胞，并得到进一步 的发展和改进。 80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行 模式试验，以探索发生同源整合的可能性。1985 年Smithies 等首次成功的运用基因打靶技术，通过带有一条表达β-球蛋 白基因的人染色体的小鼠白血病细胞，引入外援DNA 对人β球蛋白基因进行了修饰，证实了利用同源重组对生物体的遗 传信息进行定向改造的可能性。1989 年，真正通过同源重组 获得的基因敲除小鼠诞生。
基因打靶的基本环节
4 鉴定： 鉴定： 观察被击中细胞的生物学特性，并进行分子生物学检 测。可以用特异PCR 方法鉴定， PCR 引物一端以基因组 DNA 的特定基因座为模板，另一端以导入的外源基因为 模板，这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。 对经PCR 鉴定的克隆用Southern 杂交产生特殊带谱的方 法来进一步确定同源重组克隆。
基因打靶的基本环节
2 .打靶载体的导入 打靶载体的导入：外源DNA 导入的方式主要有显
微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒 法等。目前应用最广泛的是显微注射法。逆转录 病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲 合力，可用于时空特异性的基因打靶，在人类疾 病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
基因打靶的基本环节
• 3 . 筛选：由于真核细胞内发生同源重组的 筛选： 机率非常低，因此要把发生定点整合的细 胞从大量随机整合的细胞中筛选出来，就 成了基因打靶要解决的关键技术问题。目 前筛选的方案有数种，如正负双向选择法、 标记基因的特异位点表达法及聚合酶链反 应法。为了便于筛选重组阳性的细胞克隆， 目前普遍采用正负双向选择策略(PNS),此 外，也可用PCR 技术鉴定筛选基因打靶阳 性的细胞。
基因打靶技术是近20 多年兴起的分子生物学 技术，它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是 一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。作 为新兴的遗传工具，它无论是在理论研究还是在 实践应用方面都有着广阔的前景。随着人类基因 组计划的实施，越来越多的基因被发现，只有一 小部分基因的作用是已知的，将基因打靶技术与 其它生物学技术相结合对解读未知基因的功能、 调控机制和它们之间的相互关系研究起到积极的 作用，相信不久的将来会取得更多新的成果。
基因打靶技术的应用
2 在病理模型和基因治疗方面 对小鼠的MTHFR 基因进行敲除初步研究， 并为将来制 备MTHFR 基因缺陷型小鼠奠定基础。在国内， 运用基因 打靶技术hTERT-TK/GCV 联合hTERT-CD/ 5-FC 基因体 系能够靶向杀伤肝癌细胞，存在明显的旁观者效应，弥补 了治疗转染效率不高的问题，便于指导今后的试验和研究。 基因缺陷型动物模型为遗传性疾病及其他相关疾病提供研 究模型，使实现人类疾病基因治疗成为可能。 3 异体器官移植 赖良学等应用基因打靶技术在猪胎儿成纤维细胞中对 GGTA1基因进行了成功的敲除，核移植后获得了GGTA1 基因敲除猪.同年,PPL 公司的Carol 等利用体细胞二次基 因打靶技术，获得了GGTA1 双等位基因敲除猪。
基因打靶的基本环节
基因打靶载体有基因插入型载体和基因置换型载体两 种类型。插入型载体与靶基因同源的区段中含有特异的酶 切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从 而干扰目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位 点在引导序列和筛选基因的外侧，线性化后，同源重组使 染色体DNA 序列被靶载体序列替换。大多数基因敲除突 变都采取置换型载体进行基因打靶。
基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 • 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) • 精细突变的引入 • 条件性基因打靶
基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略
借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键 的外显子中， 的外显子中，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能 实行靶基因的完全剔除。 域，实行靶基因的完全剔除。进行完全基因剔除首先要 在体外进行目的基因功能的缺失突变 缺失突变。 在体外进行目的基因功能的缺失突变。
基因打靶的基本环节
1. 打靶载体的构建 ：基因打靶载体包括载 体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选 择性标记基因等非同源序列，其中同源序 列是同源重组效率的关键因素，基因打靶 载体的同源重组序列一般可通过特异性探 针从基因组DNA 文库中分离得到，也可以 利用PCR 对基因组目标的DNA 序列进行扩 增得到。
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打靶载体
基因组序列
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打靶后基因组序列
置换型载体(Gene—replacement vector)
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打靶载体
基因组序列
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打靶后基因组序列
插入型载体（Gene-inserLeabharlann Baiduion vector）
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neo 打靶载体
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基因组序列
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打靶后基因组序列
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打靶载体
基因组序列
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打靶后基因组序列
Hit and Run
基因打靶技术的应用
在医学方面的应用： 在医学方面的应用： 1 在免疫学方面的应用 将带有基因的激素直接注入受体动物可能成为疫 苗开发的一种途径，同时可用基因打靶观察某一 基因对免疫细胞所发生的影响。有些研究用基因 打靶技术破坏了CD43 基因，结果提高了T 淋巴 细胞的黏附性，为进一步观察和探讨一些免疫机 制奠定了基础。可将人类疾病相关基因或免疫抗 体基因“敲入”小鼠基因组进行表达，是基因功 能研究的有力手段。
基因打靶的策略
• 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene
可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，neo基因插入到 ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的 ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。 在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。 但此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。
基因打靶技术的应用
乳腺生物反应器： 乳腺生物反应器： 基因打靶技术制备乳腺生物反应器可以克服传统的受精卵显微注 射法的众多缺陷，并能对动物内源基因进行修饰。体细胞基因打靶— 核移植技术相结合，使乳腺生物反应器的制备得到发展，通过这种方 法可以得到转基因动物，无需筛选，降低了生产成本且大大缩短了制 作周期。国外试验组开创了“第2 代动物生物反应器模型”研究的先 2 河，直到2000 年该技术用于转基因乳腺生物反应器的研究才取得成 功。 目前已经建立了基于体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器的技术 平台。在羊的乳腺上皮组织细胞中的β-酪蛋白基因位点打靶成功的制 作出转基因的核供体。通过体细胞同源重组技术，首次成功地获得了 抗体基因敲除的山羊胎儿成纤维细胞株，该细胞株可用于体细胞克隆 制备抗体基因功能缺失的转基因山羊。体细胞核移植克隆动物技术的 发展与成功，促进了体细胞打靶制备乳腺生物反应器的发展。还有已 成功构建了人GDNF 基因打靶牛β-酪蛋白基因座的正负筛选打靶载体， 为研究人GDNF 基因在牛β-酪蛋白基因座的定点整合及通过体细胞核 移植法制备人GDNF 牛乳腺生物反应器的研究奠定了基础。
靶基因
PCR扩增
打靶载体
电穿孔法转染ES细胞
内细胞团 ES细胞
小鼠囊胚
同源重组
中靶ES细胞筛选
显微注射
胚胎移植
带突变基因的嵌合体
突变基因经生殖系统遗传
野生型
突变型
基因打靶的基本环节
基因打靶的技术要点如下： ①基因打靶载体的构建 ②打靶载体的导入 ③筛选 ④将重组阳性细胞转入动物胚胎，产生转基因动物，并进 行形态观察和分子生物学检测。
基因打靶的策略
精细突变的引入 打了就走策略 (Hit and Run 法) 双置换法 (Double Replacement法)
“标记和置换”法 (Tag and Exchange法) Cre/ LoxP 系统介导的策略
基因打靶的策略
• 条件性基因打靶
Flox-and-delete条件基因打靶
Flox-and-replace条件基因打靶 Flox-and-invert条件基因打靶
基因打靶技术的应用
培育优良品种： 培育优良品种： 基因打靶操作技术的出现，使转基因动植物研制更为精确，通过 改变动物的遗传特性，提高动物的生产性能，增强其抗病力，最终培 育出满足人们需要的高产、优质、抗病新品种。基因打靶在动物上的 应用研究取得了丰硕的成果，在各种转基因抗病动物研究中，尤其是 转基因鸡的抗病效果比较显著，将小白鼠抗流感病毒基因MXI 转至鸡 细胞中，也使鸡产生对禽流感的抗性；一些利用羊胎儿成纤维细胞中 的同源重组和羊的原代成纤维细胞高频同源重组现象的研究相继取得 成果。另有试验通过基因打靶技术获得了PRNP 基因双位点敲除牛这 种牛携带朊病毒蛋白或其他传染性蛋白。 近些年在国内，实验室研究者利用奶牛rDNA基因的ITS作为靶位 点，来研究用重复序列作为基因打靶的靶位点产生转基因奶牛的价值， 突破了DNA 重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。
基因打靶技术的原理
进行基因打靶，首先要设计和合成一个合适的打靶载体。 该载体不仅含有需要插入的DNA 序列，其两端还含有与 靶基因座上的序列相同的核苷酸片段，即同源重组指导序 列。首先将与细胞内靶基因两端特异片断同源的DNA 分 子分别连接到目的基因的两端，然后将此DNA 片段连接 到带有标记基因的载体上，再将此载体用基因转移的方法 导入靶细胞。通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序 列之间的同源重组，使外源DNA 定点整合到靶细胞的特 定基因座上。同源重组的分子机制目前尚未阐明，但已相 继提出了多种解释同源重组的模型，其中Meselson— Radding 模型不仅可以解释交互重组的现象，而且还可以 圆满地解释基因转变现象，因此被广泛接受。但Szostak 等提出的双链断裂修复模型（DSBR）能更好的解释双链 断裂可以大大提高同源重组的效率这一现象。
Double Replacement
1 2 3
靶基因组序列
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1
Hprt
3
打靶载体1
HAT ,GANC
1
Hprt
3
同源重组后序列 打靶载体2
1
2
3
6--TG
1 2 3
带有精细突变的基因组序列
Tag and Exchage
1 2 3
基因打靶的产生和发展
20 世纪90年代后，基因打靶技术得到 了普遍应用和长足发展。随着核移植和体 细胞克隆技术的发展，人们已能对体细胞 进行基因打靶，有些研究利用体细胞基因 打靶成功地获得了基因缺失导致的细胞表 型。
基因打靶的产生和发展
瑞典皇家科学院诺贝尔奖委员会宣布将 2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国 科学家马里奥-卡佩奇和奥利弗-史密西斯、 英国科学家马丁-埃文斯，以表彰他们在胚 胎干细胞和基因打靶研究方面所作的贡献。